PROTEOM I PROTEOMIKA – WPROWADZENIE

Proteom to kompletny zestaw białek danego organizmu. Termin pochodzi od angielskiego określenia „PROTEin complement  of the genOME”, czyli komponent białkowy kodowany przez genom. Proteomika to dziedzina biologii, której celem jest identyfikacja oraz poznanie struktury, funkcji i oddziaływań zakodowanych w genomie białek tworzących proteom.

Należy zwrócić uwagę na fakt, że chociaż wszystkie komórki danego organizmu posiadają wspólny genom, to w poszczególnych typach komórek i tkanek różne jego frakcje ulegają ekspresji. W konsekwencji zamiast o proteomie człowieka należałoby mówić o proteomach poszczególnych komórek i tkanek. W związku z ciągłymi zmianami stanu fizjologicznego organizmu zmianom ulegać musi również zestaw syntetyzowanych białek. W przeciwieństwie do stabilnego genomu, proteom jest więc dynamiczny i ulega ciągłym zmianom, które odzwierciedlają dynamikę stanów fizjologicznych komórki zachodzących w odpowiedzi na bodźce ze środowiska wewnętrznego i zewnętrznego. Proteomika kliniczna jest działem proteomiki, którego przedmiotem jest analiza zmian proteomu w czasie rozwoju choroby i w trakcie postępów terapii. Celem proteomiki klinicznej jest poszukiwanie różnic w proteomie osób zdrowych i chorych, związków między stanem proteomu a rodzajem i stopniem rozwoju choroby oraz zmian inicjowanych w odpowiedzi na czynniki terapeutyczne; do jej ważnych zadań należy zatem identyfikacja i scharakteryzowanie biomarkerów białkowych użytecznych w molekularnej diagnostyce choroby [1, 2].

SPEKTROMETRIA MAS – PODSTAWOWE NARZĘDZIE PROTEOMIKI

Analiza proteomu różni się od klasycznie stosowanych technik biochemicznych, które służą do identyfikowania i analizy cech pojedynczych białek. W badaniach proteomicznych łączy się metody biochemiczne, fizykochemiczne i bioinformatyczne, analizując równocześnie tysiące białek z danego typu komórek lub tkanek.

W ostatnich latach dominującym narzędziem proteomiki jest spektrometria mas – metoda umożliwiająca precyzyjny pomiar masy analizowanych cząsteczek. Analizie może zostać poddana dowolna substancja, której można nadać ładunek elektryczny (czyli zjonizować), gdyż istotą metody jest rozdział zjonizowanych cząsteczek w polu elektromagnetycznym ze względu na wartość stosunku masy do ładunku (m/z).

Typowy spektrometr masowy składa się z komory jonizacyjnej, analizatora różnicującego jony w zależności od ich wartości m/z oraz detektora rejestrującego jony, które sprzężone są z komputerowym systemem rejestracji i analizy danych. Jedną z metod jonizacji powszechnie stosowaną w spektrometrach służących do analizy peptydów i białek jest desorbcja laserowa w stałej matrycy – MALDI (ang. „Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization”). Technika MALDI polega na ko-krystalizacji cząstek substancji badanej z cząsteczkami matrycy absorbującej światło (zazwyczaj kwasów aromatycznych) i wzbudzeniu cząsteczek matrycy światłem lasera. W efekcie z kryształów desorbowane są uprotonowane cząsteczki próbki. Powstałe kationy, zazwyczaj z pojedynczym ładunkiem, nazywane są jonami molekularnymi. Spektrometry MALDI stosowane są do analizy białek o masach od ~1000 Da do nawet kilkuset tysięcy Da.

Na zbliżonej zasadzie działają spektrometry typu SELDI (ang. „Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization”). Wykorzystują one desorbcję zjonizowanych laserem cząsteczek próby z różnego typu powierzchni swoiście wiążących białka (powierzchnie takie pokryte są substancjami będącymi odpowiednikami złóż chromatograficznych). Jednym z typów analizatorów m/z często wykorzystywanych w zastosowaniach proteomicznych są analizatory czasu przelotu jonów – ToF (ang. „Time of Flight”). Analizator taki rejestruje czas przelotu zjonizowanych cząsteczek (zwykle 0,01-1 ms), który jest odwrotnie proporcjonalny do wartości m/z. Rezultat analizy masowej przedstawiany jest w postaci widma masowego, z którego można odczytać jaka liczba jonów o precyzyjnie określonej masie znalazła się w próbce poddanej jonizacji. Rycina 1 przedstawia schemat zasady działania spektrometru MALDI-ToF i przykładowe widmo białek surowicy krwi uzyskane w takim spektrometrze.

Precyzja pomiaru masy cząsteczek umożliwia wykorzystanie spektrometrii masowej do ustalania struktury danego związku, na przykład składu aminokwasów w łańcuchu peptydowym. Strukturę taką identyfikuje się na podstawie masy jonów fragmentacyjnych, wykorzystując tzw. tandemową spektrometrię mas (MS/MS). Z mieszaniny jonów molekularnych wybiera się jon wyjściowy, który w skutek zderzeń z cząsteczkami wprowadzonego gazu obojętnego rozpada się na jony fragmentacyjne. Na podstawie masy jonów fragmentacyjnych ustala się skład aminokwasowy fragmentów peptydu, a odpowiednia analiza kombinatoryczna pozwala na ustalenie sekwencji aminokwasów w łańcuchu peptydowym i identyfikację analizowanego białka. Możliwe jest również wykorzystanie do celów analityczno-diagnostycznych „prostych” profilów masowych białek rejestrowanych bez dalszej fragmentacji i identyfikacji ich sekwencji aminokwasowej. Metoda taka, bazująca na obecności w widmie charakterystycznych składników o określonej wartości m/z, nazywana jest „proteome pattern analysis” (lub też analizą profilów masowych) i stosowana często do klasyfikacji próbek (np. identyfikacji szczepów bakteryjnych). Szczególnie użyteczne do takiej analizy są metody MALDI-ToF i SELDI-ToF [3–6].

METODY ANALIZY DANYCH PROTEOMICZNYCH

Kluczowym etapem doświadczeń wykorzystujących spektrometrię mas jest analiza komputerowa zarejestrowanych widm, na potrzeby której opracowywane są specjalne narzędzia matematyczne, statystyczne i bioinformatyczne. Typowa analiza widm mieszanin białek rejestrowanych w spektrometrach MALDI i SELDI na potrzeby analiz profilów masowych składa się z trzech podstawowych etapów.

Etap pierwszy to tzw.  „pre-processing”. Celem operacji przeprowadzanych na tym etapie jest m.in. „odszumienie” sygnału, korekcja linii bazowej widma, uśrednienie powtórzeń technicznych i normalizacja sygnału umożliwiająca porównania ilościowe między próbkami.

Drugim etapem analizy jest detekcja i określenie ilości (intensywności) poszczególnych składowych widma. Na tym etapie możliwe są trzy rodzaje podejść analitycznych: porównanie wszystkich kolejnych punktów widma, detekcja pików (czyli lokalnych maksimów widma) oraz modelowanie widma jako sumy składowych. Najczęściej stosowane są podejścia wykorzystujące detekcję pików, zazwyczaj poprzedzone tzw. uliniowianiem widm (pozwala to na wyeliminowanie błędów wynikających z niewielkich przesunięć rejestrowanych pików w osi m/z).

Zidentyfikowane piki białkowe można wykorzystać do określenia właściwości profilów masowych, wykrycia cech różnicujących porównywane próbki i znalezienia korelacji między poszczególnymi składowymi widma, czyli do trzeciego etapu analizy. W etapie tym wykorzystuje się różne narzędzia statystyczne pozwalające na wyłowienie tych składowych widm (a więc rejestrowanych białek i peptydów), których poziom odróżnia porównywane próbki. W analizie takiej, podobnie jak w przypadku analizy danych mikromacierzowych z ekspresji genów, dąży się zazwyczaj do budowania wieloskładnikowych klasyfikatorów, które umożliwiają klasyfikację z wiarygodnością o wiele większą niż pojedyncze składowe. Podobnie jak w przypadku obróbki danych mikromacierzowych należy tu pamiętać o problemach związanych z wielokrotnym testowaniem (zarejestrowane widma składają się z kilkuset i więcej pików) i stosować odpowiednie metody korekcji istotności statystycznej uzyskanych wyników.

Dysponując wartościami m/z zarejestrowanych pików można pokusić się na hipotetyczną identyfikację białek. Służą do tego serwisy bioinformatyczne, które porównują wartości m/z zarejestrowanych pików widma z przechowywanymi w bazach danych odpowiednimi danymi dotyczącymi białek wcześniej analizowanych i identyfikowanych przez innych badaczy [7–9].

PROTEOMIKA KLINICZNA W DIAGNOSTYCE NOWOTWORÓW

Obiektem badań proteomiki klinicznej, podobnie jak w przypadku innych rodzajów diagnostyki medycznej, może być tkanka docelowa, w której rozwija się choroba, lub też tkanka zastępcza – najczęściej krew lub materiał pochodny (surowica lub osocze). We krwi można wykrywać białka będące produktami metabolizm komórek, w których rozwija się proces chorobowy, oraz komórek prawidłowych mających kontakt z chorą tkanką lub narządem.

Jednym z możliwych zastosowań analizy proteomu krwi jest molekularna diagnostyka nowotworów. Zmiany profilu peptydów i białek krwi mogą być zarówno przyczyną, jak i konsekwencją choroby nowotworowej, ale niezależnie od tego odzwierciedlają patologiczny stan narządu i całego organizmu, co może być wykorzystane w diagnostyce choroby. Wykorzystanie krwi jako obiektu badań proteomicznych jest z oczywistych powodów obciążone szeregiem wad, a analiza proteomu tkanki docelowej jest niewątpliwie bardziej wiarygodnym źródłem informacji o nowotworze. Jednak w przypadku badań przesiewowych, wczesnego wykrywania choroby w stadium „przedklinicznym”, wykrywania mikroprzerzutów czy diagnostyki nowotworów leczonych bez zastosowania chirurgii analiza proteomu krwi może być niezastąpioną metodą diagnostyczną.

Choroba nowotworowa ma bardzo skomplikowany obraz molekularny. W związku z tym jest bardzo mało prawdopodobne, aby pojedynczy znacznik molekularny mógł w zadowalający sposób scharakteryzować typ czy stopień zaawansowania nowotworu. Dlatego obecnie poszukuje się zestawu znaczników (czy panelu markerów), którego składniki mają przydatność diagnostyczną jako komplet. Taki panel markerów, składający się z kilku, kilkunastu lub nawet kilkudziesięciu składowych, można nazwać klasyfikatorem. Charakter takich wieloskładnikowych klasyfikatorów, już obecnie stosowanych w molekularnej diagnostyce nowotworów, mają poziomy ekspresji wybranych genów wyselekcjonowane metodami genomiki funkcjonalnej.

Można założyć z dużym prawdopodobieństwem, że analiza wieloskładnikowych zestawów białek i peptydów wybranych ze złożonych profili proteomicznych krwi również wejdzie w najbliższym czasie do praktyki klinicznej [10–13].

WYKORZYSTANIE SPEKTROMETRII MAS DO ANALIZY PROTEOMU  KRWI W MOLEKULARNEJ DIAGNOSTYCE NOWOTWORÓW

Wykorzystanie metod spektrometrii mas do analizy proteomu surowicy krwi osób z chorobą nowotworową ma zaledwie kilkuletnią historię. Pierwszą pracę w tej dziedzinie opublikował zespół Petricoin i Liotta w roku 2002. W pracy tej metoda SELDI-ToF wykorzystana została do identyfikacji w surowicy krwi peptydów swoistych dla osób z rakiem jajnika [14].

W ciągu ostatnich kilku lat opublikowanych zostało kilkadziesiąt prac testujących przydatność technik spektrometrii mas, przede wszystkim MALDI-ToF i SELDI-TOF,  do analizy tzw. niskocząsteczkowej frakcji peptydów surowicy (rzadziej osocza) pacjentów z chorobą nowotworową. Podstawowym celem tych prac było porównanie profili białkowych i wyszukanie w rejestrowanych widmach pików, których obecność i/lub intensywność odróżniała surowicę osób zdrowych i chorych na nowotwory. Badania takie pozwoliły na zaproponowanie nowych molekularnych klasyfikatorów chorób nowotworowych, opartych o właściwości rejestrowanych profilów masowych [15–18]. Duża część takich projektów proteomicznych dotyczyła identyfikacji nowych markerów o potencjalnym znaczeniu w diagnostyce raka piersi [19, 20].

Obecnie trwają intensywne prace mające na celu identyfikację białek tworzących takie klasyfikatory i weryfikację ich przydatności diagnostycznej w badaniach angażujących duże grupy chorych. Jak do tej pory jedynie nieliczne opublikowane prace dotyczą dynamiki zmian profilów masowych białek surowicy u osób poddanych terapii przeciwnowotworowej. Badania takie mogłyby pozwolić na identyfikację markerów molekularnych umożliwiających monitorowanie odpowiedzi pacjenta na zastosowaną terapię (np. jej toksyczność i skuteczność).

Celem przedstawianej pracy było wykrycie i scharakteryzowanie zmian w profilach masowych proteomu surowicy krwi, które związane były z przebiegiem terapii u pacjentek leczonych z powodu raka piersi.

SCHEMAT BADANIA I ZASTOSOWANE METODY BADAWCZWE

Badaniem objętym była grupa 70 chorych leczonych z powodu raka piersi w latach 2006–2008 w Centrum Onkologii – Instytucie im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach. Pacjentki w wieku 31–74 lat (średnia 58 lat) zdiagnozowane zostały z niskozaawansowanym nowotworem (stadium kliniczne I lub II). Wszystkie pacjentki leczone były operacyjnie; pięć osób objętych było chemioterapią neoadjuwantową, a 39 – adjuwantową chemio- i/lub radioterapią.

Próbki krwi obwodowej pobierano przed rozpoczęciem terapii (próbka A), 1–2 tygodnie po zabiegu operacyjnym (próbka B) i rok po zakończeniu terapii (próbka C; zbierana 60–90 tygodni od rozpoczęcia badania). Białka surowicy wyizolowane z zebranych preparatów krwi analizowano za pomocą spektrometru MALDI-ToF (Autoflex, Bruker Daltonics; praca w trybie liniowym). Widma rejestrowano w zakresie od 2000 do 14000 Da (cztery powtórzenia każdej próbki); przykładowe widmo przedstawione jest na rycinie 1 (B).

Zarejestrowane widma poddano opisanym wyżej procedurom obróbki wstępnej (uśrednianie, normalizacja i uliniawianie), a następnie zidentyfikowano piki białkowe jako lokalne maksima widma (korzystając z aplikacji PrepMS) [7].

W kolejnym kroku obliczono zmiany w intensywności każdej ze składowych (czyli białkowych pików widma) między parami preparatów AB i BC pochodzących od każdej z pacjentek oraz oceniono poziom znamienności statystycznej zmian obserwowanych w całej badanej grupie za pomocą wartości p (określonej za pomocą testu U Mann’a–Whitney’a) oraz wartości q (która uwzględnia problem wielokrotnego próbkowania za pomocą korekty FDR metodą Storey’a).

Analiza umożliwiła identyfikację pików białkowych, których poziom zmienił się znacząco między kolejnymi punktami czasowymi badania. Hipotetyczną identyfikację pików widma przeprowadzono za pomocą adnotacji zarejestrowanych wartości m/z do bazy danych EPO-KB (Empirical Proteomic Ontology Knowledge Base) [9], która zawiera dane o zidentyfikowanych białkach ludzkich analizowanych wcześniej metodami MALDI-ToF lub SELDI-ToF.

WYNIKI BADANIA

W zarejestrowanych widmach zidentyfikowano 264 piki odpowiadające pojedynczym białkom lub peptydom. Dla każdego piku białkowego obliczono zmianę jego intensywności między próbkami pobranymi przed rozpoczęciem terapii (próbka A), po zabiegu operacyjnym (próbka B) i rok po zakończeniu całej terapii (próbka C), oraz określono znamienność statystyczną obserwowanych zmian. Rycina 2 przedstawia wykres zależności wartości p i q dla różnic w intensywności każdego piku białkowego w parach próbek AB oraz BC.

Stwierdziliśmy, że żaden pik białkowy nie zmienił znacząco swojej intensywności między próbkami pobieranymi od danej pacjentki przed rozpoczęciem terapii i po zabiegu operacyjnym (para AB); jako próg istotności statystycznej zmiany przyjęto q=0,1. Natomiast przy porównaniu próbek pobranych po zabiegu operacyjnym i rok po zakończeniu całej terapii (para BC) stwierdzono znamienną statystycznie zmianę poziomu intensywności 61 pików białkowych.

W następnej kolejności przeprowadzono analogiczną analizę osobno dla dwu podgrup pacjentek: chorych leczonych wyłącznie chirurgicznie (n=26), oraz chorych poddanych uzupełniającemu leczeniu adjuwantowemu. Rycina 3 przedstawia wykres zależności wartości p i q dla różnic w intensywności każdego piku białkowego w parach próbek AB, oznaczony osobno dla obu podgrup pacjentek.

Stwierdziliśmy, że w grupie osób leczonych wyłącznie chirurgicznie żaden pik białkowy nie zmienił znacząco swojej intensywności między próbkami pobieranymi po zabiegu operacyjnym i rok po zakończeniu całej terapii (jako próg istotności statystycznej zmiany przyjęto q=0,1). Natomiast przy porównaniu próbek od chorych objętych terapią adjuwantową stwierdzono znamienną statystycznie zmianę poziomu intensywności 24 pików białkowych (mniejsza ilość pików różnicujących w porównaniu z analizą całej grupy pacjentek oraz niższy poziom znamienności różnic był tu wynikiem zmniejszenia liczebności badanej grupy).

Uzyskane wyniki wskazują, że operacyjne usunięcie guza nie miało bezpośredniego wpływu na zmianę profilu masowego białek surowicy, natomiast zmiany obserwowane w dłuższym okresie obserwacji były związane przede wszystkim z pooperacyjną chemio- i/lub radioterapią adjuwantową. Adnotacja wartości m/z dla 61 zarejestrowanych pików różnicujących preparaty B i C pozwoliła na hipotetyczną identyfikację 11 białek, których poziom ulegał zmianie między analizowanymi próbkami. Tabela I przedstawia zarejestrowaną wartość m/z piku różnicującego i odpowiadające mu białko (a raczej wykrywany w surowicy fragment proteolityczny takiego białka) oraz kierunek i znamienność statystyczną obserwowanej zmiany.

Do zidentyfikowanych białek surowicy o zmienionym poziomie należą białka ostrej fazy (haptoglobina, surowiczy amyloid A i inhibitor C1), których rola polega na przywracaniu homeostazy organizmu po uszkodzeniu tkanek. Druga grupa białek, których poziom ulega zmianie w trakcie terapii, to białka układu dopełniacza (witronektyna oraz białko C3) uczestniczące w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Również pozostałe białka surowicy, których zmieniony poziom wykryliśmy porównując próbki pacjentek, były wcześnie opisywane jako białka, których poziom ulega zmianie w wyniku stanów zapalnych lub obecności nowotworu.

PODSUMOWANIE

Spektrometria mas należy do podstawowych narzędzi proteomiki klinicznej. Jedno z jej popularnych zastosowań to analiza profilu masowego proteomu surowicy (i innych płynów ustrojowych). Metoda ta pozwala na szybkie wykrywanie potencjalnych markerów białkowych, które mogą być dalej charakteryzowane i weryfikowane innymi technikami badawczymi. Metoda ta może również być stosowana samodzielnie jako narzędzie wspomagające wykrywanie i diagnostykę nowotworów oraz umożliwiające monitorowanie ich terapii.

Analiza profilu białkowego wykonywana za pomocą spektrometru MALDI-ToF ma wiele zalet jako metoda analityczno-diagnostyczna – charakteryzuje się m.in. możliwością bezpośredniej analizy złożonych mieszanin, dużą tolerancją na zanieczyszczenia obecne w próbkach, możliwością analizy wielu prób w krótkim czasie i w standardowych warunkach, niewielkim kosztem pojedynczej analizy. Można założyć więc, że metoda ta wejdzie w nieodległej przyszłości do podstawowego zestawu metod molekularnej diagnostyki nowotworów.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Tyers M., Mann M.: From genomics to proteomics. Nature 2003; 422: 193-197.

2.    Patterson S.D., Aebersold R.H.: Proteomics: the first decade and beyond. Nat Genet 2003; 33: 311-332.

3.     Aebersold R., Mann M.: Mass spectrometry-based proteomics. Nature 2003; 422: 198-207.

4.     Johnstone R.A.W., Rose M.E.: Spektrometria mas. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2001. 

5.    Hortin G.L.: The MALDI mass spectrometric view of the plasma proteome and peptidome. Clin Chem 2006; 52: 1223-1237.

6.    Palmblad M., Tiss A., Cramer R.: Mass spectrometry in clinical proteomics – from the present to the future. Proteomics Clin Appl 2009; 3: 6-17.

7.     Karpievitch Y.V., Hill E.G., Smolka A.J., Morris J.S., Coombes K.R., Baggerly K.A., Almeida J.S.: PrepMS: TOF MS Data Graphical Preprocessing Tool. Bioinformatics 2007; 23:
264-265.

8.     Hilario M., Kalousis A., Pellegrini C., Müller M.: Processing and classification of protein mass spectra. Mass Spectrom Rev 2006; 25: 409-449.

9.     Lustgarten J.L., Kimmel C., Ryberg H., Hogan W.: EPO-KB: a searchable knowledge base of biomarker to protein links. Bioinformatics 2008; 24: 1418-1419.

10.    Hanash S.: Disease proteomics. Nature 2003; 422: 226-232.

11.    Wulfkuhle J.D., Liotta L.A., Petricoin E.F.: Proteomic applications for the early detection of cancer. Nature Rev Cancer 2003; 3: 267-275.

12.    Azad N.S., Rasool N., Annunziata C.M., Minasian L., Whiteley G., Kohn E.C.: Proteomics in clinical trials and practice. Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1819-1829.

13.    Cho W.C.: Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery. Mol Cancer 2007; 6: 25.

14.    Petricoin E.F., Ardekani A.M., Hitt B.A., Levine P.J., Fusaro V.A., Steinberg S.M., Mills G.B., Simone C., Fishman D.A., Kohn E.C., Liotta L.A.: Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002; 359: 572-577.

15.    Liotta L.A., Ferrari M., Petricoin E.F.: Clinical proteomics: written in blood. Nature 2003; 425: 905.

16.    Posadas E.M., Simpkins F., Liotta L.A., MacDonald C., Kohn E.C.: Proteomic analysis for the early detection and rational treatment of cancer-realistic hope? Ann Oncol 2005; 16: 16-22.

17.    Solassol J., Jacot W., Lhermitte L., Boulle N., Maudelonde T., Mangé A.: Clinical proteomics and mass spectrometry profiling for cancer detection. Expert Rev Proteomics 2006; 3: 311-320.

18.    Pietrowska M., Marczak Ł., Widłak P.: Proteomika kliniczna – wykorzystanie metod spektrometrii mas do analizy proteomu surowicy krwi w diagnostyce chorób nowotworowych. [W:] Na pograniczu chemii i biologii. Wydawnictwo UAM, Poznań 2007: 93-109. 

19.    Callesen A.K., Vach W., Jørgensen P.E., Cold S., Mogensen O., Kruse T.A., Jensen O.N., Madsen J.S.: Reproducibility of mass spectrometry based protein profiles for diagnosis of breast cancer across clinical studies: a systematic review. J Proteome Res 2008; 7: 1395 -1402.

20.    Pietrowska M., Marczak Ł., Polańska J., Behrendt K., Nowicka E., Walaszczyk A., Chmura A., Deja R., Stobiecki M., Polański A., Tarnawski R., Widłak P.: Mass spectrometry-based serum proteome pattern analysis in molecular diagnostics of early stage breast cancer. J Translat Med 2009; 7: e60.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:
 
Prof. dr hab. Piotr Widłak
Zakład Radiobiologii
Doświadczalnej i Klinicznej,
Centrum Onkologii – Instytut
im. Marii Skłodowskiej-Curie,
Oddział w Gliwicach
ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15
44-101 Gliwice
e-mail: widlak@io.gliwice.pl

Pracę nadesłano: 18.03.2010 r.
Przyjęto do druku: 22.03.2010 r.