WSTĘP

Żyjemy obecnie w erze rewolucji naukowej, charakteryzującej się gwałtownym tempem rozwoju. Przykładem mogą być osiągnięcia biologii molekularnej dokonane na przestrzeni pięćdziesięciu lat: od odkrycia struktury DNA w 1953 r. do momentu zsekwencjonowania ludzkiego genomu w 2003 r. (tab. I) [1, 2, 3].

Obecnie zacierają się granice pomiędzy poszczególnymi dziedzinami nauki, co sprawia, że staje się ona coraz bardziej interdyscyplinarna. Nie jest możliwy postęp w badaniach biologii molekularnej, jeśli nie wykorzystuje się wiedzy także z innych dziedzin, np.: inżynierii, techniki czy informatyki.

ERA „-OMIK”

Duża liczba danych oraz technik, jakie rozwinęły się na przestrzeni ostatnich dziesięcioleci, sprawiła, że zaczynamy wydzielać specjalne obszary zainteresowań w biologii komórki i nadawać im konkretne nazwy. I tak genomika zajmuje się poznaniem i analizą genomu, transkryptomika – transkryptomem, czyli zespołem wszystkich mRNA, proteomika – białkami, a metabolomika – badaniem metabolitów obecnych w organizmie, tkance czy komórce (ryc. 1).

GENOMIKA

Trudno nie doceniać możliwości, jakie dało zsekwencjonowanie ludzkiego genomu. Przede wszystkim stworzyło możliwość porównania pomiędzy prawidłową (zdrową) a chorą, patologicznie zmienioną tkanką na poziomie genomu, a wiec tysięcy genów, a nie jednego lub kilku, jak było to możliwe wcześniej. Jedną z największych korzyści wynikających z zsekwencjonowania genomu jest rozwój techniki mikromacierzy (ang. „microarray”). Obecnie dostępne są dwa główne typy mikromacierzy:

Mikromacierze oligonukleotydowe wysokiej gęstości, inaczej chipy DNA, produkowane fotolitograficznie.

Mikromacierze cDNA – nakrapiane na szkiełko biblioteki klonów DNA [4, 5].

Mikromacierze najczęściej są wykorzystywane do oceny ekspresji genów, lecz mogą także być przydatne w identyfikacji mutacji. Jedną z dziedzin, która bardzo aktywnie wykorzystuje nowoczesne techniki, jest onkologia. Techniki te mogą być pomocne w celu opracowania nowych leków przeciwnowotworowych, czy też bardziej precyzyjnego prognozowania i personalizacji leczenia onkologicznego [5, 6].

W przypadku raka piersi badania z zastosowaniem mikromacierzy doprowadziły do wyłonienia profili genowych, które umożliwiły:

1.    Rozróżnienie dwóch głównych typów raka piersi oraz ich podtypów różniących się rokowaniem: 

a)    profil charakterystyczny dla komórek gruczołowych tworzących wewnętrzną warstwę prawidłowych przewodów i zrazików piersi (dwa podtypy: luminalny A i B), 

b)    profil, w którym nie wykazano ekspresji genów charakterystycznych dla wyżej wymienionego profilu (trzy podtypy) [7].

2.    Przewidywanie odległych przerzutów i przeżycia (mammaprint, 70 genów) oraz ocenę ryzyka wznowy (oncotype Dx, 21 genów).

Obecnie trwają dwa randomizowane badania kliniczne: TAILORx (oncotype Dx) i MINDACT (EORTC Trial 10041 [BIG 3-04] MINDACT – mammaprint), mające na celu ocenę w badaniach prospektywnych przydatności tych profili genowych [6].

PROTEOMIKA

Celem prowadzenia badań proteomicznych jest ustalenie wzoru ekspresji białek i ich sekwencji oraz modyfikacji potranslacyjnych. Oznaczanie poziomu białka uzupełnia informacje uzyskane z analizy mRNA, bowiem ekspresja genów może być modulowana na poziomie zarówno mRNA, jak i białka. Informacje uzyskane z analizy mikromacierzy dostarczają informacji o profilu ekspresji genów, a nie o samym białku. Przy użyciu tej metody nie otrzymujemy informacji o oddziaływaniach produktu białkowego z innymi proteinami, a także o tym, czy białko jest fosforylowane, acetylowane, glikozylowane czy też prawidłowo cięte.

Proteomika zajmuje się głównie dwoma działami: charakterystyką ekspresji białek i charakterystyką funkcji białek. Pierwszy z nich wykorzystuje jako materiał źródłowy zarówno tkankę, jak i surowicę czy mocz. Najczęściej wykorzystywanymi metodami analizy są: elektroforeza dwukierunkowa oraz różne rodzaje spekrometrii. Ten dział proteomiki zajmuje się także odkrywaniem i oceną przydatności biomarkerów [8].

Proteomika zajmująca się oceną funkcji białka ocenia aktywność białek i ich oddziaływania między sobą. Może być stosowana do mapowania sieci szlaków sygnalizacyjnych w komórce. W analizie wykorzystywane są tkanki lub lizaty tkanek. Najczęściej stosowanymi metodami są: immunoblotting, immunoprecypitacja, histochemia, macierze tkankowe i mikromacierze białkowe [8]. Dzięki lepszemu poznaniu wzajemnych zależności między białkami, ta gałąź proteomiki może posłużyć do znalezienia nowych celów dla terapii ukierunkowanej, ocenić mechanizmy oporności na dany lek lub monitorować odpowiedź na terapię ukierunkowaną. Stosowane w tej dziedzinie proteomiki mikromacierze tkankowe są zbudowane z wielu walców wycinanych z zatopionej w bloczku parafinowym tkanki. Mogą one pochodzić z wielu lokalizacji od jednego pacjenta lub jednocześnie od wielu pacjentów. Walce te są równolegle układane w bloku parafinowym w uprzednio wyciętych otworach i uzyskany w ten sposób bloczek może zawierać do kilkuset walcowatych fragmentów tkanek o średnicy od 0,6 do 2,0 mm [9]. Stworzenie takiej mikromacierzy tkankowej pozwala na badanie białek, RNA lub DNA przy użyciu takich technik, jak immunohistochemia czy hybrydyzacja in situ.

Wiele uwagi poświęca się także technikom jonizacji laserem, wspomaganej powierzchniowo z analizatorem czasu przelotu SELDI-TOF (ang. „surface-enhaced laser desorption/ionization time-of-flight”), i jonizacji laserem wspomaganej matrycą z analizatorem przelotu MALDI-TOF (ang. „matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight”) [10, 11, 12]. W przypadku techniki MALDI-TOF można analizować nie tylko zawiesiny białek, ale także materiał z niezhomogenizowanej tkanki, np.: skrawki kriostatowe [10]. Na badany materiał tkankowy napyla się krystalizującą macierz pochłaniającą światło lasera. W przypadku zawiesiny białek miesza się ją z roztworem krystalizującej macierzy i nanosi na płytkę ze stali nierdzewnej. Naświetlenie laserem dostarcza energii potrzebnej do przejścia peptydów z badanej próbki w stan gazowy. Peptydy te są następnie poddane silnemu polu eklektycznemu, a w analizatorze mierzony jest czas ich przelotu. Pozwala on ustalić wielkość poszczególnych peptydów i współczynnik masy do wartości ładunku elektrycznego, które zależą od rodzaju badanego peptydu.

W przypadku techniki SELDI-TOF próbkę zawierającą badany materiał (izolowane białka z krwi, surowicy, komórek lub też lizatów komórkowych) nanosi się na modyfikowaną chemicznie powierzchnię wiążącą określony z góry typ białek, np.: hydrofobowe (płytki ProteinChip). Następnie płukanie usuwa sole oraz białka, które wiązały się niespecyficznie z danym rodzajem ProteinChip [11]. Płytkę z białkami pokrywa się materiałem absorbującym światło (czyli matrycą) i naświetla laserem. Następne etapy są podobne jak w technice MALDI-TOF.

W technikach spektrometrii mas nie wymagana jest wcześniejszej wiedza o analizowanych białkach, ponieważ w tej metodzie uzyskuje się specyficzną sygnaturę białek, która może być użyta do rozróżnienia między „prawidłową” i „chorą” tkanką, lub też pomiędzy łagodną a złośliwą zmianą [10]. Do tej pory spektrometria mas była narzędziem badawczym. Wprowadzenie jej do medycyny, a w szczególności do diagnostyki, będzie wiązało się z koniecznością standaryzacji procedur uzyskiwania i obróbki próbek oraz kontrolą jakości.

Innym obiecującym narzędziem proteomiki są mikromacierze białkowe. Obecnie wykorzystywane mikromacierze białkowe można podzielić na dwa główne typy: „forward phase array” i „reverse phase array”. W przypadku pierwszej techniki na podłożu unieruchomione są cząsteczki wiążące się z poszukiwanymi białkami, np.: przeciwciała, a następnie nakładany jest lizat tkanki. Białka w lizacie mogą być znakowane znacznikiem lub, gdy stosowany jest nieznakowany lizat po związaniu białek z przeciwciałami, w kolejnym etapie mogą być zastosowane wyznakowane przeciwciała wiążące się z innym epitopem tego samego białka niż przeciwciało unieruchomione na płytce. W tej technice jeden punkt mikromacierzy zawiera jeden typ przeciwciała, a na płytkę nakrapiany jest lizat od jednego pacjenta, co umożliwia wykazanie u niego ekspresji setek białek.

W przypadku techniki „reverse phase array” na płytce unieruchomiony jest lizat tkanki w każdym punkcie mikromacierzy od innego pacjenta. Płytkę inkubuje się z jednym rodzajem przeciwciała [13]. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu do techniki „forward phase array”. Stosuje się jedno przeciwciało na wszystkie próbki – warunki barwienia są więc jednakowe dla wszystkich próbek. Umożliwia to wykazanie nawet niewielkich różnic w ilości białka pomiędzy próbkami. Ponieważ nie stosujemy znakowania białek lizatu lub dodatkowego przeciwciała, unika się różnic w barwieniu lizatów pochodzących z różnych próbek i w maskowaniu epitopów [10]. 

W przypadku różnego rodzaju oznaczeń białek izolowanych z tkanki niezmiernie ważnym czynnikiem jest heterogenność materiału. W przypadku nowotworu w analizowanej próbce oprócz komórek nowotworowych mogą być obecne fibroblasty, komórki epitialne i mioepitelialne, leukocyty, komórki tworzące naczynia krwionośne. Problem ten można rozwiązać dzięki metodzie laserowego pozyskiwania mikroskrawków (ang. „LCM Laser Capture Microdissection”). Pozwala ona na precyzyjne wycięcie interesującego nas rejonu ze skrawka i pozyskanie homogennej populacji komórek [10, 14, 15]. Można używać skrawków kriostatowych, parafinowych, a nawet wybarwionych archiwalnych skrawków po usunięciu szkiełka nakrywkowego [14].

NOWE DZIEDZINY: CYTOMIKA, MIKRORNOMIKA, INTERAKTOMIKA

Szybki postęp nauki i lepsze poznanie skomplikowanej struktury komórki powoduje wyodrębnienie coraz to nowszych dziedzin, takich jak: cytomika czy mikroRNomika (ang. „microRNomics”). Cytomika to multimolekularna, cytomeryczna analiza zróżnicowania komórki i systemów komórkowych (układów komórek), która w połączeniu z wiedzą informatyczną uzyskaną z analizy próbki umożliwia zrozumienie molekularnej struktury i funkcjonowania systemu komórkowego. Metody pozwalające ocenić wiele parametrów w jednej komórce to: analiza obrazowa oraz cytometria przepływowa, która obecnie umożliwia analizę ekspresji do 17 białek w jednej komórce. Cytomika służy do oceny zróżnicowania fenotypów komórek w próbce na podstawie wyróżnienia w niej różnych typów komórek znajdujących się w różnych stanach funkcjonalnych [16].

Wraz z odkryciem miRNA i zrozumieniem jego ważnej roli w komórce, rozwinęła się następna dziedzina: mikroRNomika. Zajmuje się ona identyfikacją, ekspresją, strukturą i biologiczną funkcją miRNA. MiRNA to niewielkie, niekodujące cząsteczki RNA kontrolujące ekspresję genów poprzez kierowanie ich mRNA na drogę degradacji lub wyciszenia translacji. Do chwili obecnej zidentyfikowano ponad 700 rodzajów miRNA, które kontrolują, jak się przypuszcza, ok. 30% genów ludzkiego genomu, biorąc udział w regulacji takich procesów, jak: różnicowanie, proliferacja, ruchliwość i apoptoza. Dlatego też zaburzenia funkcji miRNA mogą prowadzić do chorób, takich jak: nowotwory, upośledzenie funkcjonowania układu immunologicznego, zaburzenia metaboliczne lub choroba sercowo-naczyniowa. Najbardziej przydatną techniką mikroRNomiki jest analiza macierzy miRNA. Stworzona została już baza sekwencji miRNA – ang. „miRBase Sequence Database”, do której ciągle dodawane są nowe sekwencje. Dostępne są też mikromacierze miRNA nie tylko dla ludzi, ale i zwierząt laboratoryjnych (myszy i szczurów). Informatyczne, komputerowe narzędzia służą w mikroRNomice głównie do identyfikacji miRNA i znalezienia ich docelowych mRNA, które mogą stać się tarczami w terapii celowanej. Dane otrzymane przy pomocy mikromacierzy miRNA czy też narzędzi informatycznych powinny być potwierdzone za pomocą takich technik, jak: Nothern blot, reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym, hybrydyzacji in situ.

W ostatnich latach zidentyfikowano w wielu nowotworach zmiany ekspresji miRNA. Badania wykazały, że niektóre miRNA zachowują się jak geny supresorowe i nazwano je TS-miRami (ang. „tumor suppressor miRs” – TS-miRs), a inne jak onkogeny i nazwano je onkomirami. W przyszłości miRNA mogą stać się nowym celem dla terapii ukierunkowanej i zostać wykorzystane jako terapeutyki. Problemem jest jednak precyzyjne dostarczenie oligonukleotydów anty-miRNA do chorej tkanki. Ponieważ nie działają one wybiórczo na chore komórki, ale mogą reagować również ze zdrowymi, efekty uboczne takiego leczenia mogą być bardzo poważne [17].

W celu dokładnego zrozumienia działania jakiegoś czynnika lub reakcji całej komórki niezbędne jest połączenie informacji pochodzących z różnych źródeł analizy. Możemy wtedy stworzyć tzw. interaktom, czyli złożoną mapę wszystkich interakcji pomiędzy np. białkami czy też pełny obraz zależności między genami, RNA, metabolitami i proteinami. Interaktomika jest więc interdyscyplinarną dziedziną nauki łączącą biologię molekularną, bioinformatykę, chemię i biofizykę. Celem interaktomiki porównawczej jest porównywanie relacji i reakcji pomiędzy „omami” różnych gatunków. W przyszłości może to doprowadzić do opracowania nowych leków i zrozumienia ich działania, co w konsekwencji pomoże uniknąć reakcji ubocznych po ich zastosowaniu.

NANOTECHNOLOGIE W MEDYCYNIE

Dzięki możliwościom, jakie stworzyły nowe technologie, zaczynamy badać zjawiska zachodzące w organizmie człowieka na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Dlatego też nanotechnologia wkracza coraz szerzej do medycyny i znajduje możliwe zastosowanie w wielu jej dziedzinach, takich jak:

• obrazowanie struktur subkomórkowych – np. mikroskop sił atomowych

• wykorzystanie nanocząsteczek (kropki kwantowe, nanacząsteczki złota, srebra, krzemionki) jako znaczników przyłączonych np. do przeciwciał czy leków

• diagnostyka: oparte o technologię nanocząsteczek macierze, metody „bio-barcode assay”, „lab-on-a-chip”, nanobiosensory

• implanty wykonane z nanomateriałów, np.: nanokompozytowe biomateriały typu tytan-hydroksyapatyt, w inżynierii tkankowej do regeneracji kości – nanoceramika [18, 19]

Skonstruowanie mikroskopu sił atomowych oraz skaningowego mikroskopu optycznego bliskiego pola umożliwiło dokładniejszy i głębszy wgląd w komórkę niż konwencjonalne mikroskopy optyczne i umożliwiło obserwację zjawisk biologicznych na poziomie cząsteczkowych, a nawet atomowym. Zastosowanie nanocząsteczek otwiera także nowe możliwości obrazowania struktur czy białek wewnątrz komórki, a także w organizmie. Kropki kwantowe, ze względu na swoje rozmiary i cechy fizyczne, wydają się być idealnymi znacznikami fluorescencyjnymi dla sond DNA i przeciwciał monoklonalnych oraz systemów wizualizacji. Charakteryzują się bowiem szerokim spektrum absorpcji i wąskim emisji, co pozwala na jednoczesne wzbudzenie kilku rodzajów kropek przez jedną długość fali. Dodatkowo są one fotostabilne, co pozwala na archiwizację materiału, np.: wybarwionych skrawków parafinowych [20, 21]. Innym zastosowaniem nanocząsteczek jest choćby nieinwazyjne wykrywanie komórek dzięki wykorzystaniu związków znakowanych nanocząsteczkami perfluorokarbonowymi lub superparamagnetycznymi cząstkami tlenków żelaza [20]. Połączenie kropek kwantowych z komórkami, których zawiesinę podano potem drogą iniekcji do organizmu, pozwala na śledzenie ich losów [22].

Diagnostyka laboratoryjna i obrazowa może już w bliskiej przyszłości wykorzystywać kilka typów nanocząsteczek. Najczęściej badanymi i używanymi są nanocząsteczki złota, kropki kwantowe i magnetyczne nanocząsteczki [20]. Duże nadzieje wiąże się z możliwością zastosowania w przyszłości w obrazowaniu (np. utlenowania tkanki) kropek kwantowych z emisją światła w bliskiej podczerwieni. Obecnie trwają badania na zwierzętach nad użytecznością kropek kwantowych w obrazowaniu in vivo [21, 22]. O ile w przypadku diagnostyki in vitro nie musimy się obawiać potencjalnych efektów toksycznych, to jednak dalej pozostaje wiele pytań dotyczących losów nanocząsteczek wprowadzonych do ciała. Obawy dotyczą głównie nanocząsteczek mniejszych niż 20 nm, które mogą wnikać do komórek, a w przypadku kropek kwantowych zastrzeżenia budzą toksyczne jony kadmu, selenu, rtęci, ołowiu, które w przypadku rozpadu kropki mogą być uwalniane do organizmu [20, 21, 22].    

Nanotechnologie tworzą także możliwości tworzenia nowych systemów detekcji związków. Nanobiosensory są bardzo czułymi sensorami, wytwarzanymi w sposób sztuczny, wrażliwymi na substancje chemiczne i biologiczne. Umożliwiają identyfikacje różnych związków na podstawie wiązania nawet pojedynczej cząsteczki i działają zarówno w środowisku cieczy i gazu. Opracowano prototypy biosensorów wykrywających kwasy nukleinowe, białka i jony. Znany jest szeroki zakres typów nanobiosensorów oprócz elektrycznych i elektrochemicznych; jako nanobiosensory wykorzystuje się także mikrobelki lub nanorurki węglowe. Jeszcze inną klasę nanosensorów stanowią nanosensory wykorzystujące technikę powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (SERS). Produkowany przez firmę Oxonica zestaw Nanoplex Biotags pozwala na pomiar wielu różnych cząsteczek w jednym teście [20].

Dzięki nanotechnologii powstają szybsze i czulsze metody, takie jak: techniki „bio-barcode assay” i „lab-on-a-chip”, które już niedługo mogą znaleźć zastosowanie w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej.

W technice „bio-barcode assay” do wykrycia np. białka czy wirusa stosuje się dwa typy cząsteczek:

a)    mikroskopijne magnesy połączone z cząsteczkami rozpoznającymi szukany związek (np. z przeciwciałami),

b)    nanocząsteczki złota sprzężone z drugą cząsteczką (np. przeciwciało) także rozpoznającą ten sam szukany związek. Do nanocząsteczek złota doczepione są też setki nici DNA.

Technika ta może być zastosowana do identyfikacji różnych patogenów. Gdy patogen znajduje się w próbce, przeciwciała łączą się z nim, tworząc sieć z cząstkami magnetycznymi, złotymi kulkami i DNA. W polu magnetycznym można taki kompleks wydzielić z roztworu, a następnie uwolnić DNA z nanocząsteczek złota. Wykrycie obecności DNA potwierdza obecność patogenu w próbce [23, 24].

Miniaturowe systemy typu „lab-on-a-chip” pozwalają na wykonanie wielu oznaczeń laboratoryjnych na pojedynczym chipie wielkości kilku centymetrów kwadratowych. Płytki krzemowe, szklane lub polimerowe zawierają miniaturowe kanały, studzienki, komory i przestrzenie reakcyjne, w których mogą zachodzić po kolei różne reakcje w zależności od konstrukcji chipu. Technika ta pozwala na przeprowadzenie oznaczeń z wykorzystaniem niewielkiej ilości płynu (pikolitry) i może stanowić alternatywę dla klasycznych metod laboratoryjnych [25, 26, 27].

 Oprócz zastosowań nonocząsteczek w diagnostyce próbuje się wykorzystać nanocząsteczki oparte na biodegradowalnych polimerach do dostarczenia leku specyficznie, w miejsce jego działania, np. do mikrośrodowiska nowotworu. Wykorzystuje się drogę zarówno pasywnego, jak i aktywnego dostarczenia leku (ryc. 2). Większość polimerów wykazuje zwiększoną przenikalność do tkanki nowotworowej, co jest związane z występowaniem nieprawidłowych, nieszczelnych naczyń i brakiem odprowadzania limfy z nowotworu. Innym sposobem jest wykorzystanie mikrośrodowiska nowotworu, gdzie lek jest uwalniany i selektywnie przetwarzany w obrębie nowotworu. Aktywne dostarczenie leku wiąże się z podaniem leku połączonego z nanocząsteczką i z substancją, która łączy się z węglowodorami, receptorami lub antygenami obecnymi na powierzchni komórki nowotworowej. Obecnie trwają badania kliniczne mające na celu sprawdzenie działania leków połączonych z syntetycznymi polimerami. Przykładem takiego nowoczesnego terapeutyku może być PK1 (N-2-(hydroksypropyl)-metakryloamid-doksorubicyna). Innym przykładem zastosowania nanocząsteczek jest Abraxane, zawierający nanocząsteczki zbudowane z albuminy surowicy ludzkiej i paklitakselu [28].

BIOINFORMATYKA

Dokonujący się obecnie w medycynie ogromny postęp związany z nowymi technologiami, dostarcza taką ilość danych, którą nie jesteśmy stanie zanalizować i skatalogować, wykorzystując stosowane dotychczas metody. Dlatego też coraz większe znaczenie zaczyna pełnić bioinformatyka.

Tworzenie elektronicznych baz sekwencji genów pomaga w wyznaczaniu sekwencji homologicznych, prognozowaniu struktury i funkcji makromolekuł. Istnieją oczywiście problemy związane z interpretacją wyników, np. z analizy mikromacierzy. Koniecznością staje się standaryzacja narzędzi obliczeniowych używanych do statystycznej obróbki otrzymanych danych [29, 30].

Gromadzone dane mogą posłużyć do identyfikacji nowych biomarkerów oraz do indywidualizacji leczenia. Stworzone zostały olbrzymie bazy danych zawierające sekwencje genomu, takie jak: GenBank, EMBL (European Molecular Biology Labolatory Nucleotide Sequence Database) czy DDBJ (DNA Data Bank of Japan). Porównywanie sekwencji całych genomów pozwala na wgląd w szlaki biochemiczne, genetyczne i ewolucję organizmów. Jednakże w celu zrozumienia złożonych zależności pomiędzy genem a produktem genu, należy wykorzystać połączone informacje z wielu dziedzin (genomiki, proteomiki, metabolomiki). Niezbędne będą więc narzędzia informatyczne, potrafiące analizować dane różnych typów pochodzących z różnych baz [30].

Istnienie baz danych gromadzących informacje z dziedziny genomiki, proteomiki i metaboliki może pomóc w identyfikacji nowych biomarkerów charakteryzujących stan chorobowy (np. nowotwór). Choroby cechują się zazwyczaj heterogennością i scharakteryzowanie ich za pomocą jednego tylko markera w większości przypadków nie jest możliwe. W przypadku nowotworów jeden biomarker nie jest w stanie scharakteryzować np. typu tkanki i stopnia zróżnicowania. W przyszłości idealnym rozwiązaniem byłoby zastosowanie zestawu markerów, które precyzyjnie scharakteryzowałyby konkretny przypadek. Jednak droga od problemu do zastosowania określonego zestawu biomarkerów jest długa i zawiera kilka ważnych etapów, takich jak wybór potencjalnych biomarkerów czy też ocena ich przydatności (ryc.3).

Obecnie dostępnych jest wiele narzędzi bioinformatycznych przeznaczonych do zarządzania informacjami otrzymanymi z mikromacierzy: MAGMA, ILOOP, GEPAS, CARMAweb. Oczywiście sam wybór kandydatów na biomarkery może zależeć od typu próbki i rodzaju analizy. Dlatego tworzone są bazy danych (np. Gene Ontology – GO) pozwalające na interpretację funkcji genów i narzędzia informatyczne (GoMiner, AmiGO, BiNGO, GOEAST) pozwalające na poszukiwanie w nich takich informacji [31].

NOWE NARZĘDZIA BIOLOGII MOLEKULARNEJ W EPIDEMIOLOGII I TOKSYKOLOGII

Biologia molekularna wkroczyła także do dziedzin związanych z medycyną, takich jak epidemiologia i toksykologia. Model opisujący obecnie powstanie choroby zakłada ekspozycję na środowiskowe czynniki ryzyka, ich dystrybucję w organizmie i metabolizm, ale również bierze pod uwagę wpływ, jaki mogą one wywierać na drogi sygnalizacyjne w komórce prowadzące do różnych efektów, takich jak: różnicowanie komórek, apoptoza czy naprawa DNA. Powstają pytania o zmianę ekspresji genów spowodowaną ekspozycją na czynnik, o zależności dawka–efekt czy wpływ zróżnicowania genetycznego na profil ekspresji genów. Dlatego też mikromacierze oraz inne narzędzia proteomiki oceniające tysiące cech, mogą okazać się przydatne również w tej dziedzinie [32].

Również toksykologia zajmując się testowaniem i oceną bezpieczeństwa nowych produktów zaczyna korzystać ze współczesnych narzędzi biologii molekularnej. Toksykogenomika bada odpowiedź genomu na czynniki środowiskowe i toksyny. Łączy ona genetykę, badanie ekspresji mRNA, białek i metabolitów z bioinformatyką i konwencjonalną toksykologią [32]. Lepsze zrozumienie mechanizmów oddziaływania czynnika na organizm pozwoli na zawężenie obszaru poszukiwań substancji mogących być nowymi biomarkerami, co w przyszłości może zaowocować zmniejszeniem czasu badań przedklinicznych, a także obniżeniem liczby zwierząt w doświadczeniach [33]. Lepsze zrozumienie mechanizmów odpowiedzi na czynnik toksyczny może pozwolić na przewidzenie reakcji, a zmiany na poziomie ekspresji genów, RNA i białek mogą służyć jako wczesne, bardzo czułe indykatory potencjalnej toksyczności.

Dotychczas tradycyjne badania toksykologiczne były prowadzone zazwyczaj przy użyciu wysokich dawek. Biologia molekularna pozwala natomiast na ocenę działania czynnika po użyciu bardzo niewielkich dawek. Ponadto metody biologii molekularnej umożliwiają zebranie informacji o biologicznych efektach działania niższych dawek niż wywołujące toksyczność. Obecnie dostępne techniki dają też możliwość oceny działania wielu różnych czynników. Przypomina to sytuację w środowisku człowieka, gdzie jest on wystawiony na działanie różnych czynników toksycznych występujących zazwyczaj w niewielkim stężeniu [34].

PROBLEMY ETYCZNE I SOCJALNE ZWIAZANE Z POSTĘPEM W MEDYCYNIE

Oczywiście wraz z szeroko pojętym postępem w biologii molekularnej, technice i medycynie coraz bardziej prawdopodobna staje się wizja praktycznego wykorzystania wiedzy. Może to dotyczyć zapobiegania chorobom, diagnostyki, przewidywania i leczenia dostosowanego do konkretnego pacjenta. Jednakże mimo niezaprzeczalnych korzyści, jakie mogą przynieść te nowe metody, pojawiają się także problemy natury etycznej i społecznej dotyczące danych osobowych pacjenta.

Tak jak dotychczas, wszelkie wyniki i dane pacjenta powinny być chronione i udostępniane tylko upoważnionym osobom. Jednakże istnieją wątpliwości, czy obecnie obowiązujące prawo jest w stanie zapewnić dostateczną ochronę danych. Sytuacja wymaga odpowiedzialności nie tylko badacza czy lekarza, ale również pacjenta, u którego wykryto np. predyspozycje genetyczne. Pacjent będzie musiał bowiem zdecydować, czy powiadomić bliskich o wynikach swoich badań, wiedząc, że i oni mogą znajdować się w grupie ryzyka [35].

W dobie coraz większego rozwoju nowych technik i metod wprowadzenie ich do praktyki klinicznej w dużym stopniu będzie zależało od poziomu edukacji zarówno badaczy, jak i lekarzy, a także ich ścisłej współpracy zarówno między sobą, jak i bioinformatykami specjalizującymi się w różnorodnych dziedzinach, takich jak: matematyka, chemia, biologia, fizyka czy nauki komputerowe [30, 35].

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1. Passarge E.: Chronologia ważnych wydarzeń w genetyce. [W:] Mazurkiewicz T. (red.): Genetyka – ilustrowany przewodnik. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2004: 13-17.

2. Słomski R., Szalata M., Wielgus K.: Poznanie genomu człowieka i perspektywy analiz DNA. [W:] Słomczyński R. (red.): Analiza DNA – teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, Poznań 2008: 24-29.

3. Drewa G.: Historia rozwoju genetyki. [W:]. Drewna G., Ferenc T. (red.): Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy. Wydawnictwo Medyczne Urban i Partner, Wrocław 2003: 1-9.

4. Jarząb B., Gubała E., Lange D.: Mikromiacierze DNA i profil ekspresji genów raka brodawkowego tarczycy. Endokrynol Pol 2005; 56 (3): 293-301.

5. Workman P.: The impact of genomic and proteomic technologies on the development of new cancer drugs. Ann Oncol 2002; 13 (4): 115-124.

6. Roukos D.H., Murray S., Briasoulis E.: Molecular genetic tools shape a roadmap towards a more accurate prognostic prediction and personalized management of cancer. Cancer Biol Ther 2007; 6 (3): 308-312.

7. Sørlie T.: Molecular portraits of breast cancer: tumor subtypes as distinct disease entities. Eur J Cancer 2004; 40 (18): 2667-2675.

8. Azad N.S., Rasool N., Annunziata C.M., Minasian L., Whiteley G., Kohn E.C.: Proteomics in clinical trials and practice: present uses and future promise. Mol Cell Proteomics 2006; 5 (10): 1819-1829.

9. Voduc D., Kenney C., Nielsen T.O.: Tissue microarrays in clinical oncology. Semin Radiat Oncol 2008; 18 (2): 89-97.

10. Calvo K.R., Liotta L.A., Petricoin E.F.: Clinical proteomics: from biomarker discovery and cell signaling profiles to individualized personal therapy. Biosci Rep 2005; 25 (12): 107-125.

11. Lewandowicz A., Bakun M., Imiela J., Dadlez M.: Proteomika w uronefrologii – nowe perspektywy diagnostyki nieinwazyjnej? Nefrologia i Dializoterapia Polska 2009; 13 (1): 15-21.

12. Waksmański B., Olejek A.: Proteomika w prognozowaniu wystąpienia raka jajnika: rzeczywistość i nadzieje. Przegląd menopauzalny 2006; 6: 352-357.

13. Sheehan K.M., Calvert V.S., Kay E.W. i wsp.: Use of reverse phase protein microarrays and reference standard development for molecular network analysis of metastatic ovarian carcinoma. Mol Cell Proteomics 2005; 4 (4): 346-355.

14. Fend F., Raffeld M.: Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol 2000; 53 (9): 666-672.

15. Petricoin E.F., Liotta L.A.: Clinical applications of proteomics. J Nutr 2003; 133 (7): 2476-2484.

16. Valet G.: Cytomics as a new potential for drug discovery. Drug Discov Today 2006; 11 (17-18): 785-791.

17. Zhang C.: MicroRNomics: a newly emerging approach for disease biology. Physiol Genomics 2008; 33 (2): 139-147.

18. Jurczyk M.: zastosowanie osiągnięć nanotechnologii w terapii nowotworowej. Gin Prakt 2009; 3: 21-26.

19. Kaźnica A., Joachimiak R., Drewa T., Rawo T., Deszczyński J.: Nowe trendy w inżynierii tkankowej. Artroskopia i Chirurgia Stawów 2007; 3 (3): 11-16.

20. Jain K.K.: Applications of nanobiotechnology in clinical diagnostics. Clin Chem 2007; 53 (11): 2002-2009.

21. Xing Y., Rao J.: Quantum dot bioconjugates for in vitro diagnostics & in vivo imaging. Cancer Biomark 2008; 4 (6): 307-319.

22. Smith A.M., Duan H., Mohs A.M., Nie S.: Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60 (11):1226-1240.

23. Goluch E.D., Nam J.M., Georganopoulou D.G. i wsp.: A bio-barcode assay for on-chip attomolar-sensitivity protein detection. Lab Chip 2006; 6 (10): 1293-1309.

24. Hill H.D., Mirkin C.A.: The bio-barcode assay for the detection of protein and nucleic acid targets using DTT-induced ligand exchange. Nat Protoc 2006; 1 (1): 324-336.

25. Gulati S., Rouilly V., Niu X., i wsp.: Opportunities for microfluidic technologies in synthetic biology. J R Soc Interface 2009; 6 (4): 493-506.

26. Liu W.T., Zhu L.: Environmental microbiology-on-a-chip and its future impacts. Trends Biotechnol 2005; 23 (4): 174-179.

27. Ziober B.L., Mauk M.G., Falls E.M., Chen Z., Ziober A.F., Bau H.H.: Lab-on-a-chip for oral cancer screening and diagnosis. Head Neck 2008; 30 (1): 111-121.

28. Sinha R., Kim G.J., Nie S., Shin D.M.: Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5 (8): 1909-1917.

29. Kim J.H.: Bioinformatics and genomic medicine. Genet Med 2002; 4 (6): 62-65.

30. Molidor R., Sturn A., Maurer M., Trojanowski Z.: New trends in bioinformatics: from genome sequence to personalized medicine. Exp Gerontol 2003; 38 (10):1031-1036.

31. Phan J.H., Moffitt R.A., Stokes T.H. i wsp.: Convergence of biomarkers, bioinformatics and nanotechnology for individualized cancer treatment. Trends Biotechnol 2009; 27 (6): 350-358.

32. Waters M.D., Selkirk J.K., Olden K.: The impact of new technologies on human population studies. Mutat Res 2003; 544 (2-3): 349-360.

33. Hewitt P., Herget T.: Value of new biomarkers for safety testing in drug development. Expert Rev Mol Diagn 2009; 9 (6): 531-536.

34. Aardema M.J., MacGregor J.T.: Toxicology and genetic toxicology in the new era of ‚toxicogenomics’: impact of ‚-omics’ technologies. Mutat Res 2002; 499 (1): 13-25.

35. Konstantinopoulos P.A., Karamouzis M.V., Papavassiliou A.G.: Educational and social-ethical issues in the pursuit of molecular medicine. Mol Med 2009; 15 (1-2): 60-63.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Dr n. med. Agnieszka Adamczyk
Zakład Radiobiologii Klinicznej
Centrum Onkologii – Instytut
im. Marii Skłodowskiej-Curie,
Oddział w Krakowie
ul. Garncarska 11
31-115 Kraków
tel.: 12 422 99 00 wew. 371
e-mail: aa.adamczyk@yahoo.com

Pracę nadesłano: 26.02.2010 r.
Przyjęto do druku: 08.04.2010 r.