WSTĘP

Osteopontyna (OPN) została po raz pierwszy opisana jako białko charakterystyczne dla stransformowanych komórek nabłonkowych [1]. Następnie wykazano, że jest to białko powstające w komórkach macierzy kostnej, warunkujące umiejscowienie w niej osteoklastów [2]. Osteopontyna jest ufosforylowaną glikoproteiną wiążącą wapń, o charakterze cytokiny, uczestniczącą w regulacji mineralizacji tkanki kostnej. Poza osteoklastami i osteoblastami OPN ulega ekspresji w wielu innych typach komórek i tkanek oraz jest wydzielana do płynów ustrojowych, m.in. krwi i mleka [3, 4]. Wzrost stężenia OPN w krwi obwodowej obserwuje się także w ostrych i przewlekłych stanach zapalnych. Sugeruje się, że białko to ma właściwości zarówno pro- jak i przeciwzapalne [3]. Ponadto bierze ono udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej [5] oraz inicjowaniu zmian miażdżycowych w naczyniach [6]. Uważa się, że za różnorodność funkcji pełnionych przez osteopontynę odpowiadają różne modyfikacje potranslacyjne jakim ulega to białko.

Szereg opublikowanych prac dotyczy roli osteopontyny w procesie kancerogenezy oraz progresji i przerzutowania różnych nowotworów. W badaniach immunohistochemicznych wielu typów nowotworów zaobserwowano nadekspresję OPN w tkance guza w porównaniu z tkankami prawidłowymi. Stwierdzono ponadto, że stopień ekspresji białka zależy od zaawansowania procesu nowotworowego, a zwiększonej ekspresji OPN w tkance guza odpowiada – również w sposób zależny od stopnia zawansowania choroby – wzrost stężenia tego białka w krwioobiegu [7]. Wykazano także, iż wysoki poziom OPN we krwi koreluje ze wzrostem ryzyka nawrotu choroby oraz krótszym czasem przeżycia chorych [7, 8, 9]. Stwierdzono, że stężenie OPN w krwi obwodowej może korelować z hipoksją, a zatem z potencjalną radiowrażliwością guza [10, 11]. Przedstawione powyżej doniesienia sugerują, że osteopontyna może być wartościowym markerem prognostycznym, o potencjalnych walorach predykcyjnych.

Dane piśmiennictwa wskazują na możliwość wykorzystania osteopontyny jako markera progresji choroby w przypadku raka piersi. Stwierdzono, że stężenie OPN we krwi chorych na raka piersi wzrasta wraz z zaawansowaniem procesu nowotworowego oraz koreluje z czasem wolnym od nawrotu choroby i całkowitym czasem przeżycia [12, 13, 14]. U chorych na nowotwory, w tym raka piersi, stwierdzono występowanie czterech form molekularnych tego białka: OPN-a, OPN-b, OPN-c oraz OPN-d; co istotne, formę OPN-c wykryto wyłącznie w komórkach linii inwazyjnych raka piersi [15].

CEL PRACY

Celem prezentowanej pracy była analiza stężenia osteopontyny w osoczu krwi chorych na raka piersi w nisko zaawansowanym stadium oraz wykrycie zmian poziomu OPN związanych z leczeniem tych chorych.

MATERIAŁ I METODY

Badana grupa. Badaniem objęto grupę 73 chorych na raka piersi, leczonych w latach 2006-2008 w Centrum Onkologii – Instytucie im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach. Rozpoznanie kliniczne ustalono na podstawie badania histopatologicznego. Pacjentki w wieku 38-72 lat (mediana 58 lat) zdiagnozowane zostały w nisko zaawansowanym stadium choroby (I-II stopień zaawansowania klinicznego). Stopień zaawansowania klinicznego oceniany był na podstawie badań obrazowych oraz badania przedmiotowego, zgodnie z klasyfikacją TNM. Wielkość guzów określona została jako T1 lub T2 (55% i 45%, odpowiednio), stopień zajęcia węzłów chłonnych jako N0 lub N1 (75% i 25%, odpowiednio). Schemat leczenia chorych objętych badaniem przewidywał zabieg chirurgiczny oraz adjuwantową chemio- lub chemio-radioterapię. Grupę kontrolną stanowiło 50 kobiet w wieku 32-77 lat, bez zdiagnozowanych schorzeń i nie leczonych onkologicznie. Projekt badania zaakceptowany został przez Komisję Bioetyczną Centrum Onkologii – Instytutu o/Gliwice, a wszystkie chore po zapoznaniu się z protokołem wyraziły świadomą, dobrowolną zgodę na udział w badaniu.

Metody analityczne. Stężenie osteopontyny w osoczu krwi oznaczane było z wykorzystaniem testu R&D Systems, metodą ELISA. Zastosowane w teście przeciwciało rozpoznaje wszystkie cztery formy osteopontyny (OPN-a, OPN-b, OPN-c, OPN-d) i ich fragmenty proteolityczne obecne we krwi. Do oznaczeń pobierano 4 mL krwi żylnej do probówek próżniowych, zawierających EDTA jako antykoagulant. Próbki krwi pobierano przed rozpoczęciem leczenia onkologicznego (próbka A), około 2 tygodnie po zabiegu operacyjnym (próbka B) i około roku po zakończeniu terapii (próbka C; 60-90 tygodni od rozpoczęcia badania).

Analiza statystyczna. Opracowanie statystyczne wykonano z wykorzystaniem programu STATISTICA (wersja 7.1). Dla oceny różnic wartości stężenia OPN w grupie chorych na raka piersi w porównaniu z grupą kontrolną użyto testu statystycznego Kruskal-Wallisa, natomiast dla oceny zmian poziomu OPN podczas leczenia chorych wykorzystano test Wilcoxona. W celu identyfikacji podgrup pacjentek zastosowano analizę skupień metodą klasteryzacji nienadzorowanej wykorzystującej algorytm K-średnich z funkcją korelacji. Oceny korelacji pomiędzy kierunkiem zmian w stężeniu OPN a czynnikami klinicznymi dokonano w oparciu o test χ2 lub test Anova. W analizie przyjęto stosowany w badaniach medycznych poziom istotności p<0,05.

WYNIKI

Dane piśmiennictwa wskazują, że stężenie osteopontyny we krwi wzrasta u chorych z zaawansowaną chorobą nowotworową. Pierwszym celem pracy było zatem sprawdzenie, czy poziom tego białka jest podwyższony w osoczu krwi chorych na raka piersi zdiagnozowanych we wczesnym (I/II) stopniu zawansowania klinicznego. Przeprowadzona analiza wykazała statystycznie znamienne (p=0,0003) wyższe stężenie osteopontyny w osoczu chorych na raka piersi w porównaniu z grupą kontrolną. Wyniki oznaczeń stężenia OPN w grupie kontrolnej oraz chorych na raka piersi (przed rozpoczęciem leczenia) przedstawione zostały w tabeli I. Nie wykazano natomiast istotnych różnic w stężeniu tego białka u chorych pomiędzy grupami w I i II stopniu zaawansowania klinicznego.

Kolejnym celem badania była analiza zmian stężenia OPN związanych z przebiegiem leczenia onkologicznego. W pierwszej kolejności porównano wartości stężenia OPN oznaczone przed rozpoczęciem leczenia (próbka A) oraz ok. miesiąc później, po przeprowadzonym operacyjnym usunięciu guza (próbka B). W badanej grupie chorych po zabiegu chirurgicznym stwierdzono istotny statystycznie spadek stężenia OPN (p=0,0005) (tab. II). Tym niemniej, chociaż stopień resekcji guza uznano za całkowity u wszystkich chorych, u ponad 20% (16/71) po operacji nie zaobserwowano spadku stężenia białka..

Następnie porównano wartości stężenia OPN oznaczone przed rozpoczęciem leczenia (A), po zabiegu chirurgicznym (B) oraz rok po zakończeniu leczenia chorych (C). Ta część analizy wykonana została w grupie 35 chorych. Wykazano, że u ponad połowy chorych w tej grupie poziom OPN nie był istotnie niższy rok po zakończeniu leczenia (C) niż stężenie wyjściowe (A) [46,9±18,1 ng/mL i 57,2±11,8 ng/mL, odpowiednio].

W kolejnym etapie badania przeprowadziliśmy analizę skupień (cluster analysis), która pozwoliła na zidentyfikowanie dwu podgrup chorych, u których dynamika zmian poziomu OPN miała odmienny charakter (ryc.1). W podgrupie I stężenie OPN uległo około 5-krotnemu obniżeniu po zabiegu operacyjnym w porównaniu ze stężeniem wyjściowym (próbki A i B), a następnie odnotowano wzrost stężenia białka oznaczanego rok po zakończeniu terapii (próbki B i C). Obydwie zmiany były znamienne statystycznie (tab. III). Co istotne, stężenie OPN oznaczone rok po zakończeniu leczenia było w dalszym ciągu znamiennie niższe niż oznaczone u tych samych chorych przed rozpoczęciem terapii. Przeciętna różnica indywidualna pomiędzy oznaczeniami A i C wynosiła 21.3±17.4 ng/mL. W podgrupie II chorych zmiany poziomu OPN nie miały charakteru regularnego lub też stężenie białka nie zmieniało się pomiędzy kolejnymi oznaczeniami w analizowanych trzech punktach czasowych (tab. III, ryc.1).

Końcowym etapem badania było sprawdzenie czy bi-modalny charakter zmian poziomu OPN (dwie opisane wyżej wyodrębnione podgrupy chorych) powiązany jest z wybranymi cechami klinicznymi, tj. rozmiarem guza, stopniem zajęcia węzłów chłonnych i ich wielkością, stopniem złośliwości i typem histologicznym guza, poziomem ekspresji receptorów estrogenów i progesteronu, ekspresją receptorów HER, stężeniem hemoglobiny oraz liczbą leukocytów oznaczanych przed rozpoczęciem leczenia. Wykazaliśmy korelację pomiędzy dynamiką zmian stężenia osteopontyny a stopniem zajęcia lokalnych węzłów chłonnych (p=0,05). Wszystkie chore, u których odnotowaliśmy silny spadek stężenia OPN po operacji (podgrupa I) zakwalifikowane były, zgodnie z klasyfikacją TNM, do grupy N0 czyli bez zajętych węzłów chłonnych (ryc. 2A). Nie stwierdziliśmy istotnych statystycznie związków między bi-modalnym charakterem dynamiki zmian stężenia OPN a pozostałymi analizowanymi cechami klinicznymi. Co ciekawe, stwierdziliśmy natomiast korelację pomiędzy kierunkiem zmian stężenia OPN a wiekiem chorych (p=0,023). Podgrupa I, charakteryzująca się silnym spadkiem stężenia OPN po przeprowadzonym zabiegu operacyjnym, w przeważającej części obejmowała pacjentki młodsze, w wieku poniżej mediany w całej grupie (ryc.2B).

DYSKUSJA

W szeregu prac klinicznych wykazano wzrost poziomu osteopontyny w różnych nowotworach [16, 17, 18]. Stwierdzono, że OPN odgrywa znaczącą rolę w progresji guza i powstawaniu przerzutów. Czynnikami wpływającymi na te procesy są m.in. zdolność OPN do interakcji z powierzchniowymi receptorami (integryny czy receptor CD44), proteinazami (metaloproteazy, aktywator plazminogenu typu urokinazy) a także czynnikami wzrostu (VEGF – czynnik wzrostu śródbłonka naczyń czy TGF – transformujący czynnik wzrostu) [19]. Osteopontyna odgrywa znaczącą rolę w przekazywaniu i regulacji sygnałów komórkowych mających wpływ na transformację nowotworową [16]. Udział tego białka w angiogenezie, procesie mającym zasadnicze znaczenie dla progresji guza, związany jest z wysokim powinowactwem OPN do αvβ3 integryn [19] oraz indukcją ekspresji czynnika VEGF [20]. Natomiast interakcje OPN z receptorem CD44 wpływają na inwazyjność i zdolność migracji komórek nowotworowych a w konsekwencji tworzenie przerzutów [19, 21].

W opublikowanych pracach wykazano, że stężenie OPN w osoczu wzrasta istotnie u chorych z wysoko zaawansowanym (przerzutującym) rakiem piersi [22]. W przedstawianym badaniu stwierdziliśmy znamiennie wyższe stężenie OPN w osoczu krwi chorych z nisko zaawansowanym rakiem piersi w porównaniu z grupą kontrolną, natomiast nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic w stężeniu OPN pomiędzy grupami chorych z nowotworem w I i II stopniu zaawansowania klinicznego. Uzyskany wynik wskazuje zatem na przydatność oznaczeń osteopontyny również dla wczesnej diagnostyki raka piersi. Wykazaliśmy ponadto, że u większości chorych stężenie OPN spada znacząco po zabiegu chirurgicznym, co sugeruje przydatność takich oznaczeń w ocenie radykalności leczenia chirurgicznego.

Dane piśmiennictwa wskazują na związek osteopontyny z powstawaniem bardziej złośliwego fenotypu komórek nowotworowych, co wiąże się z podwyższonym potencjałem migracji i inwazyjności. Dodatnią korelację pomiędzy nadekspresją osteopontyny a ryzykiem zajęcia węzłów chłonnych obserwowano między innymi w przypadku zaawansowanego raka piersi [14, 23]. Wyniki naszych badań, w których wykazaliśmy korelację pomiędzy stężeniem OPN w osoczu a stopniem zajęcia lokalnych węzłów chłonnych, potwierdzają istnienie powyższego związku oraz wskazują na możliwe znaczenie prognostyczne takiej analizy. Interesującym wynikiem pracy jest zaobserwowana korelacja między charakterem dynamiki zmian stężenia OPN a wiekiem chorych. Dostępne dane piśmiennictwa dotyczące korelacji pomiędzy stężeniem OPN a wiekiem chorych zarówno potwierdzają istnienie takiego związku (np. u chorych na raka regionu głowy i szyi [24]), jak i wskazują na jego brak (np. u chorych na raka płuca [25]). Jednakże brak dotychczas publikacji dotyczących takiej korelacji u chorych na raka piersi. 

WNIOSKI

Wyniki uzyskane w prezentowanej pracy pozwalają na sformułowanie szeregu wniosków

1. Stwierdziliśmy statystycznie znamienny wzrost stężenia OPN w osoczu chorych z nisko zaawansowanym rakiem piersi w porównaniu z grupą osób zdrowych, co sugeruje przydatność oznaczeń tego białka we wczesnej diagnostyce raka piersi

2. Wykazaliśmy statystycznie znamienny spadek stężenia OPN w osoczu chorych poddanych chirurgicznej resekcji guza, co sugeruje przydatność oznaczeń tego białka dla monitorowania efektów leczenia operacyjnego

3. Zaobserwowaliśmy statystycznie znamienny związek pomiędzy dynamiką zmian stężenia OPN w osoczu krwi podczas leczenia a stopniem zajęcia lokalnych węzłów chłonnych, co z kolei sugeruje przydatność oznaczeń tego białka dla celów prognostycznych

Przedstawione badanie miało charakter pilotażowy, a potwierdzenie możliwej wartości diagnostycznej i rokowniczej oznaczeń stężenia osteopontyny w osoczu chorych na raka piersi w nisko zaawansowanym stadium wymaga przeprowadzenia szerszego badania, na większej grupie chorych, uwzględniającego dłuższy okres obserwacji po zakończeniu leczenia przeciwnowotworowego.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Senger D.R., Wirth D.F., Hynes R.O.: Transformed mammalian cells secrete specific proteins and phosphoproteins. Cell 1979; 16: 885-893.

2.    Ross F.P., Chappel J., Alvarez J.I. et al.: Interactions between the bone matrix proteins osteopontin and bone sialoprotein and the osteoclast integrin alpha v beta 3 potentiate bone resorption. J Biol Chem 1993; 268: 9901-9907.

3.    O’Regan A., Berman J.S.: Osteopontin: a key cytokine in cell-mediated and granulomatous inflammation. Int J Exp Pathol 2000; 81: 373-90.

4.    Sodek J., Ganss B., McKee M.D.: Osteopontin. Crit Rev Oral Biol Med 2000; 11: 279-303.

5.    Xanthou G., Alissafi T., Semitekolou M. et al.: Osteopontin has a crucial role in allergic airway disease through regulation of dendritic cell subsets. Nat Med 2007; 13: 570-578.

6.    Fitzpatrick L.A., Severson A., Edwards W.D., Ingram R.T.: Diffuse calcification in human coronary arteries. Association of osteopontin with atherosclerosis. J Clin Invest 1994; 94: 1597-1604.

7.    El-Tanani M.K., Campbell F.C., Kurisetty V., Jin D., McCann M., Rudland P.S.: The regulation and role of osteopontin in malignant transformation and cancer. Cytokine Growth Factor Rev 2006; 17: 463-474.

8.    Chakraborty G., Jain S., Behera R., Ahmed M., Sharma P., Kumar V., Kundu G.C.: The multifaceted roles of osteopontin in cell signaling, tumor progression and angiogenesis. Cur Mol Med 2006; 6: 819-830.

9.    Coppola D., Szabo M., Boulware D., Muraca P., Alsarraj M., Chambers A.F., Yeatman T.J.: Correlation of osteopontin protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologies. Clin Cancer Res 2004; 10: 184-190.

10.    Nordsmark M., Eriksen J.G., Gebski V., Alsner J., Horsman M.R., Overgaard J.: Differential risk assessments from five hypoxia specific assays: The basis for biologically adapted individualized radiotherapy in advanced head and neck cancer patients. Radiother Oncol 2007; 83: 389-397.

11.    Said H.M., Katzer A.: Response of the plasma hipoxia marker osteopontin to in vitro hipoxia in human tumor cells. Radiother Oncol 2005; 76: 200-205.

12.    Rudland P.S., Platt-Higgins A., El-Tanani M., De Silva Rudland S., Barraclough R., Winstanley J.H., Howitt R., West C.R.: Prognostic significance of the metastasis-associated protein osteopontin in human breast cancer. Cancer Res 2002; 62: 3417-3427.

13.    Allan A.L., George R., Vantyghem S.A. et al.: Role of the integrin-binding protein osteopontin in lymphatic metastasis of breast cancer. Am J Pathol 2006; 169: 233-246.

14.    Rudland P.S., Platt-Higgins A., El-Tanani M., De Silva Rudland S., Barraclough R., Winstanley J.H., Howitt R., West C.R.: Prognostic significance of the metastasis-associated protein osteopontin in human breast cancer. Cancer Res 2002; 62: 3417-3427.

15.    Mirza M., Shaughnessy E., Hurley J.K., Vanpatten K.A., Pestano G.A., He B., Weber G.F.: Osteopontin-c is a selective marker of breast cancer. Int J Cancer 2008; 122: 889-897.

16.    Johnston N.I., Gunasekharan V.K., Ravindranath A., O’Connell C., Johnston P.G., El-Tanani M.K.: Osteopontin as a target for cancer therapy. Front. Biosci 2008; 13: 4361-4372.

17.    Wai P.Y., Kuo P.C.: Osteopontin: regulation in tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev 2008; 27: 103-118.  

18.    Mrochem J., Bartnik W.: Osteopontyna – nowy marker w chorobach nowotworowych. Współczesna Onkologia 2008; 12: 349-353.

19.    Rodrigues L.R., Teixeira J.A., Schmitt F.L., Paulsson M., Lindmark-Mänsson H.: The role of osteopontin in tumor progression and metastasis in breast cancer. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev 2007; 16: 1087-1097.

20.    Chakraborty G., Jain S., Kundu G.C.: Osteopontin promotes Vascular Endothelial Growth Factor-dependent breast tumor growth and angiogenesis via autocrine and paracrine mechanisms. Cancer Res 2008; 68: 152-161.

21.    Desai B., Rogers M.J., Chellaiah M.A.: Mechanisms of osteopontin and CD44 as metastatic principles in prostate cancer cells. Mol Cancer 2007; 6: e18.

22.    Plumer A., Duan H., Subramaniam S., Lucas F.L., Miesfeldt S., Ng A.K., Liaw L.: Development of fragment-specific osteopontin antibodies and ELISA for quantification in human metastatic breast cancer. BMC Cancer 2008; 8: e38.

23.    Allan A.L., George R., Vantyghem S.A., Lee M.W., Hodgson N.C., Engel C.J., Holliday R.L., Girvan D.P., Scott L.A., Postenka C.O, Al-Katib W., Stitt L.W., Uede T., Chambers A.F., Tuck A.B.: Role of the integrin-binding protein osteopontin in lymphatic metastasis of breast cancer. Am J Pathol 2006;169: 233-46.

24.    Bache M., Reddemann R., Said H.M., Holzhausen H.J., Taubert H., Becker A., Kuhnt T., Hänsgen G., Dunst J., Vordermark D.: Immunohistochemical detection of osteopontin in advanced head-and-neck cancer: prognostic role and correlation with oxygen electrode measurements, hypoxia-inducible-factor-1alpha-related markers, and hemoglobin levels. Int. J Radiat Oncol Biol Phys 2006; 66:1481-7.

25.    Chang Y.S., Kim H.J., Chang J., Ahn C.M., Kim S.K., Kim S.K.: Elevated circulating level of osteopontin is associated with advanced disease state of non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2007; 57: 373-80.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Prof. dr hab. Piotr Widłak
Centrum Badań Translacyjnych i Biologii
Molekularnej Nowotworów,
Centrum Onkologii
– Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie,
Oddział w Gliwicach;
ul. Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-101 Gliwice
e-mail: widlak@io.gliwice.pl