Rak płuca jest obecnie najczęściej występującym nowotworem złośliwym na świecie (1,6 miliona przypadków rocznie; 13% ogółu zachorowań na nowotwory) i stanowi główną przyczynę zgonów z powodu chorób nowotworowych u obu płci oraz dziesiątą przyczynę wszystkich zgonów na świecie (1,4 miliona w roku 2008, co stanowi 18% ogółu zgonów) [1]. Statystyki amerykańskie podają, że rak płuca zabija więcej chorych, niż rak piersi, jelita grubego i gruczołu krokowego łącznie [2]. W Polsce rak płuca odpowiada za ponad 25% ogółu zachorowań nowotworowych u mężczyzn (1. miejsce) i około 8% u kobiet (3. miejsce po raku piersi i jelita grubego). Na przestrzeni ostatnich 40 lat zachorowalność mężczyzn w naszym kraju wzrosła ponad dwukrotnie: z 36,8 na 100 000 w 1970 roku do 85,2 w 2004 roku i utrzymuje się na podobnym poziomie od końca lat 90. XX wieku [3].

Uważa się, że jedną z podstawowych przyczyn takiego stanu jest brak skutecznych metod diagnostycznych, pozwalających na efektywne prowadzenie badań przesiewowych w grupach wysokiego ryzyka i umożliwiających dostatecznie wczesne wykrycie zmian chorobowych w płucach. Pomimo znaczącego postępu, jaki w ciągu ostatnich dziesięcioleci dokonał się w diagnostyce raka płuca, wprowadzenie niskodawkowej tomografii komputerowej, czy też nowoczesnych technik bronchoskopowych nie zmieniło w znaczącym stopniu poziomu wczesnej wykrywalności. W większości przypadków rak płuca jest nadal rozpoznawany późno, w 70% w stadium IIIB lub IV, kiedy z powodu miejscowego zaawansowania choroby lub obecności odległych przerzutów możliwości interwencji terapeutycznej są znacznie ograniczone, a jej efekty niezadowalające. Wiadomo, że czas przeżycia pacjentów leczonych z powodu wcześnie wykrytych zmian nowotworowych jest znamiennie dłuższy i przekracza okres 5 lat w ponad 80% przypadków, podczas gdy w grupie pacjentów w stadium IV choroby wskaźniki te wynoszą poniżej 3% [4]. Wydaje się, że skutecznym sposobem poprawy efektów leczenia i ograniczenia śmiertelności z powodu raka płuca jest nie tylko rozwój nowych terapii, ale również wdrożenie do praktyki klinicznej znacząco skuteczniejszych metod możliwie wczesnej diagnostyki tej choroby.

Liczne badania bardzo dobrze dokumentują kluczowe znaczenie, jakie w patomechanizmie nowotworów złośliwych odgrywa nieprawidłowa aktywność genów uczestniczących w regulacji kluczowych procesów życiowych komórki – jej cyklu oraz różnicowania, dojrzewania, starzenia i apoptozy. Niekontrolowany wzrost guza nowotworowego jest efektem zachwiania fizjologicznej równowagi poprzez aktywację protoonkogenów odpowiadających za intensywny wzrost patologicznych tkanek oraz unieczynnienie genów supresorowych transformacji nowotworowej (TSG – Tumour Supressor Genes). Za sprawą modyfikacji genetycznych (mutacje, aberracje chromosomowe, utrata heterozygotyczności) bądź epigenetycznych (metylacja, aktywność mikroRNA) istotnym zmianom podlega ekspresja wielu genów, w tym onkogenów i genów supresorowych nowotworów lub czynność kodowanych przez nie białek, zaburzając efektywność naturalnych mechanizmów regulujących homeostazę komórek i tkanek organizmu.

Dla przykładu, typowe dla niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP) obniżone zapotrzebowanie na dopływ czynników wzrostowych związane jest w znacznej mierze ze wzmożoną aktywnością genów z rodziny ERBB, kodujących receptor dla nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor) oraz koreceptor dla EGFR, HER2/Neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2). Z kolei następstwem zaburzonej ekspresji genów TP53 (Tumour Protein p53) i BCL2 (B-cell CLL/lymphoma 2) obserwowanej odpowiednio w 50% i 30% przypadków NDRP oraz w prawie 90% drobnokomórkowego raka płuca (DRP) jest zahamowanie apoptozy, naturalnego mechanizmu regulującego długość życia komórek, szczególnie istotnego dla procesu eliminacji tych z uszkodzoną lub nieprawidłową strukturą DNA. Inne często obserwowane zmiany w ekspresji genów związane są z utratą heterozygotyczności (LOH – Loss Of Heterozygosity) w locus genów TP53 i p16 (CDKN2A – Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A), prowadzącej do oporności na regulację wzrostu przez czynniki parakrynne, a także ze wzmożoną aktywnością neoangiogenną w obrębie tkanek nowotworowych (wysoka ekspresja genów VEGF – Vascular Epithelial Growth Factor i VEGFR – Vascular Epithelial Growth Factor Receptor), regulacją zdolności do replikacji komórek (geny telomerazy) oraz nabyciem zdolności do naciekania tkanek i tworzenia przerzutów (geny laminin i integryn) [5, 6]. Dzięki postępowi technologicznemu jaki dokonał się w metodyce badan molekularnych, zaburzenia te są efektywnie wykrywane w ludzkich tkankach nowotworowych i mogą odgrywać rolę biomarkerów użytecznych dla rozpoznania procesu kancerogenezy in vivo [5].

Istotne znaczenie dla potencjalnego zastosowania określonych biomarkerów w klinice raka płuca ma również fakt, że ilość i charakter zmian stwierdzanych na poziomie molekularnym istotnie koreluje ze stopniem zaawansowania zmiany nowotworowej. Często wspomina się nawet o pewnej sekwencyjności ich występowania, wynikającej z faktu, że konkretne markery są charakterystyczne dla określonych etapów rozwoju choroby nowotworowej [6, 7] (ryc. 1). Tak zwane zmiany wczesne, jak utrata heterozygotyczności w chromosomalnych rejonach 3p oraz 9p21, są stwierdzane już na etapie niewielkich zaburzeń struktury nabłonka oddechowego pod postacią hiperplazji czy też metaplazji. Co więcej, zaburzenia metylacji promotorów określonych genów obserwowane są u nałogowych palaczy już w komórkach morfologicznie prawidłowego nabłonka oddechowego. Różnice w ekspresji biomarkerów występują także na etapie zmian przednowotworowych typu dysplazji, a stają się częstsze i bardziej nasilone w carcinoma in situ oraz postaci inwazyjnej raka płuca.

Z progresją nowotworu związane jest nasilenie wielorakich zaburzeń – utraty części materiału genetycznego (np. delecje fragmentów chromosomów), rearanżacji chromatyny, występowania spontanicznych bądź indukowanych mutacji, a także zmian epigenetycznych – nadmiernej ekspresji genów oraz ich metylacji.

Zidentyfikowanie zaburzeń molekularnych towarzyszących rozwojowi raka płuca i scharakteryzowanie dynamiki ich rozwoju stwarza obiecującą perspektywę ich wykorzystania we wczesnym wykrywaniu i leczeniu choroby jako markery diagnostyczne, prognostyczne, jak również predykcyjne. Wiele spośród znanych mutacji genowych (m.in. ALK – Anaplastic Lymphoma receptor tyrosine Kinase, HER2, PI3K – Phosphatidylinositol 3-kinase, AKT – Protein Kinase B, BRAF –v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, MAP2K1 – Mitogen-Activated Protein kinase kinase 1, MET – Met proto-oncogen- hepatocyte growth factor receptor) ma charakter silnie promujący kancerogenezę (driver mutations), a produkty ekspresji tak zmutowanych genów stanowią potencjalne cele molekularne dla nowej klasy leków w terapiach celowanych (tab. I) [8-14].

MARKERY MOLEKULARNE WE WCZESNEJ DIAGNOSTYCE RAKA PŁUCA

Idealny biomarker powinien w sposób jednoznaczny charakteryzować istotną z klinicznego punktu widzenia cechę badanej tkanki (rozrost nowotworowy, stopień zaawansowania guza, wrażliwość lub oporność na leczenie), cechować się wysoką wiarygodnością diagnostyczną (odpowiednia czułość i swoistość oznaczenia), nie wymagać inwazyjnych procedur pobierania materiału biologicznego oraz wysokich kosztów wykonania oznaczeń [15]. Rzeczywista wartość kliniczna badań molekularnych w diagnostyce raka płuca jest więc przede wszystkim zarówno wynikiem doboru właściwych biomarkerów, jak i dostępności materiału biologicznego, w którym ich poszukujemy [16].

Nowoczesne techniki molekularne pozwalają na efektywne i wiarygodne badanie mutacji i ekspresji dowolnych genów i białek w tkance nowotworowej, a podstawowym materiałem diagnostycznym wciąż pozostaje tkanka z guza pierwotnego płuca pozyskiwana metodami inwazyjnymi (resekcja chirurgiczna, nakłucie przez ścianę oskrzela lub klatki piersiowej). W oczywisty sposób nakłada to ograniczenia dla szerszego i bardziej efektywnego zastosowania diagnostyki molekularnej w praktyce klinicznej.

Tymczasem wiadomo już, że charakterystyczne dla raka płuca markery są obecne nie tylko w materiale genetycznym uzyskanym z komórek samego guza, ale również w plwocinie, popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych oraz surowicy i osoczu krwi chorych [16].

Klasyczne badanie cytologiczne plwociny charakteryzuje się stosunkowo niską wartością diagnostyczną (za wyłączeniem zmian położonych centralnie w świetle oskrzela). Natomiast wykorzystanie technik molekularnych daje realne szanse na opracowanie metodologii charakteryzujących się zarówno wysoką czułością, jak i swoistością [17]. Jako szczególnie obiecującą należy wymienić metodę wizualizacji jądra komórkowego (Nuclear Image Analysis) przy pomocy odpowiednich barwień. Technika półautomatycznej oceny komórek tą metodą charakteryzuje się czułością 45% i swoistością 90%, a jej udoskonalona, w pełni zautomatyzowana wersja, pozwalająca w dużej mierze uniknąć błędów związanych z subiektywną oceną badającego wykazała się bardzo dobrą czułością (75%) i swoistością (90%). Duże nadzieje wiąże się również z zastosowaniem innych technik: barwienia standardową metodą immunocytochemiczną z użyciem przeciwciał np. przeciwko heterogennej ryboproteinie jądrowej, oceny metylacji promotorów niektórych genów (p16INK4A, RASSF1A – Ras Association Domain Family Member 1), czy też wykorzystaniem metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH – Fluorescent In Situ Hybridisation) do analizy zmian genetycznych na poziomie chromosomalnym [18, 19].

Przydatność analizy plwociny technikami biologii molekularnej we wczesnej diagnostyce raka płuca potwierdzają obserwacje Jiang i wsp., którzy u chorych w stadium IA choroby wykazali porównywalną swoistość (89% vs 92%) tomografii komputerowej i badania indukowanej plwociny (geny HYAL2 – Hyaluronoglucosaminidase 2, FHIT – Fragile Histidine Triad gene, SP-A – Surfactant Protein A1, p16), przy znamiennie wyższej czułości metody obrazowej (85% vs 70%). Z kolei kompleksowe zastosowanie obu metod pozwoliło uzyskać znamiennie wyższą czułość diagnostyczną (91%), z zachowaniem wysokiej swoistości (92%) [20]. Molekularna analiza indukowanej plwociny wydaje się zatem obiecującym uzupełnieniem innych metod diagnostycznych, niejednokrotnie bardziej uciążliwych i obciążonych większym ryzykiem powikłań. Pod warunkiem doboru odpowiednich markerów może znaleźć również zastosowanie we wczesnej diagnostyce raka płuca, zwłaszcza w skojarzeniu z innymi badaniami, przede wszystkim obrazowymi.

Metodą umożliwiającą pozyskanie materiału komórkowego z bardziej dystalnych oskrzeli jest płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL – Bronchoaveolar Lavage). Molekularna analiza materiału z BAL prezentowała co prawda wyższą wartość diagnostyczną niż konwencjonalne badanie cytologiczne, jednak częstość pozytywnej detekcji najbardziej typowych dla NDRP zmian molekularnych w obrębie DNA, m.in. mutacji genów TP53 i KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene homolog) oraz hipermetylacji p16, była znacząco niższa niż w przypadku analizy materiału z guza pierwotnego (odpowiednio 53% i 100%) [21, 22, 23, 24]. Uważa się, że zasadniczą przyczyną niskiej czułości molekularnej analizy płynu z BAL, a więc i potencjalnej przydatności klinicznej, jest niewielka zawartość w tym materiale komórek nowotworowych w stosunku do komórek prawidłowych (przede wszystkim makrofagów pęcherzykowych, leukocytów i komórek nabłonka).

Bardzo obiecujące perspektywy szerokiego zastosowania w molekularnej diagnostyce raka płuca ma natomiast inny łatwo dostępny materiał biologiczny, jakim jest krew obwodowa. Charakteryzuje ją bogata zawartość składników komórkowych i molekularnych, a procedura pobrania – łatwością wykonania, niskim kosztem i bardzo niewielkimi wymaganiami technicznymi. Ponadto szeroki wybór standardowych procedur pobierania, przechowywania, transportu i frakcjonowania krwi, opracowanych pierwotnie na potrzeby analityki medycznej, ułatwia jej ewentualne zastosowania praktyczne w diagnostyce molekularnej. Tym samym krew spełnia główne kryteria charakteryzujące materiał przydatny dla prowadzenia diagnostyki przesiewowej.

Już w 1948 r. odnotowano we krwi obwodowej obecność pozakomórkowej frakcji kwasów nukleinowych, a stwierdzenie w tym materiale szeregu zmian genetycznych i epigenetycznych – typowych dla tkanki nowotworowej – w sposób jednoznaczny powiązało zjawisko wolnego-krążącego DNA (free-circulating DNA) z mechanizmami rozwoju i wzrostu guza [25]. Przypuszcza się, że źródłem istotnej części pozakomórkowego DNA obecnego we krwi chorych na nowotwór jest sam guz, który aktywnie uwalnia do krążenia znaczące ilości materiału genetycznego w następstwie procesów apoptozy i/lub nekrozy, bądź też pochodzi ono z rozpadu krążących komórek nowotworowych [26]. Nanogramowe ilości wolnego-krążącego DNA wykrywane są również w osoczu i surowicy osób zdrowych, osób z przewlekłymi chorobami zapalnymi oraz autoimmunologicznymi, jednak jego poziom u chorych na raka jest zwykle znamiennie wyższy, najpewniej z powodu unikalnej specyfiki procesów biologicznych towarzyszących rozwojowi guza [16].

Potencjał kliniczny analizy biomarkerów obecnych w frakcji krążącego DNA krwi obwodowej został dostrzeżony bardzo szybko, jednak intensywne badania nad przydatnością różnych paneli biomarkerów, oznaczanych z zastosowaniem rozmaitych technik molekularnych, nie przyniosły jednoznacznie pozytywnych wyników, a ton doniesień w piśmiennictwie fachowym jest zróżnicowany – od niezwykle entuzjastycznego po raczej umiarkowany.

Sozzi i wsp., dzięki zastosowaniu czułej metody PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) uzyskali adekwatną dla celów diagnostyki klinicznej swoistość i czułość ilościowej analizy wolnego DNA we krwi obwodowej, wykazując średnio aż ośmiokrotnie wyższy poziom DNA u chorych na raka płuca w porównaniu ze zdrowymi (24,3 vs 3,1 ng mL-1) [27]. Wysoki poziom DNA nie był zależny od palenia tytoniu i wiązał się z 85-krotnie większym ryzykiem zachorowania na NDRP. Ci sami autorzy zaobserwowali znamiennie wyższe stężenie wolnego DNA we krwi palaczy, którzy zachorowali na raka płuca w okresie pięcioletniej obserwacji. Poziom DNA był wyższy już w bezobjawowym stadium choroby nowotworowej układu oddechowego, z tendencją do dalszego wzrostu w okresie poprzedzającym rozpoznanie. Jednak uzupełnienie programu corocznych badań tomograficznych klatki piersiowej 1037 palaczy o analizę stężenia wolnego DNA w osoczu nie wpłynęło istotnie na efektywność wczesnej diagnostyki raka płuca [28].

Jak wspomniano powyżej, w wolnym-krążącym DNA obecne są biomarkery genetyczne i epigenetyczne charakterystyczne dla zmiany pierwotnej w płucu, takie jak niestabilność mikrosatelitarna (MI – Microsatellite Instability), mutacje onkogenów m. in. KRAS i TP53, modyfikacje genów supresorowych transformacji nowotworowej, czy też genów naprawy DNA (genów mutatorowych) [29]. Na podstawie dotychczas opublikowanych badań do najbardziej obiecujących biomarkerów można zaliczyć najczęściej obserwowane i stosunkowo wczesne mutacje TP53 (obecne w osoczu u 73% pacjentów z mutacją w guzie pierwotnym), 3p LOH (47,5%), zmiany metylacji genów APC (Adenomatous Polyposis Coli) (47%), p16INK4a (55%), DAPK (Death-Associated Protein Kinase) (40%) oraz RASSF1A (31%) [16]. Beau-Faller i wsp. ocenili diagnostyczną przydatność 12 markerów mikrosatelitarnych zlokalizowanych w 9 różnych regionach chromosomów, uzyskując pozytywny wynik w 17 z 20 przebadanych surowic pacjentów z niedrobno- i drobnokomórkowym rakiem płuca (czułość 85%). Co niezmiernie istotne, w grupie kontrolnej wszystkie oznaczenia dały wynik negatywny [30]. Równie zachęcające wyniki opublikowali Ulivi i wsp., którzy porównali częstość występowania hipermetylacji p16INK4A i CDH13 (Cadherin 13, H-cadherin) w surowicy i tkankach guza [31]. Natomiast inne zespoły analizujące wartość diagnostyczną zestawów składających się z pięciu markerów potwierdziły obecność zmian molekularnych jedynie u odpowiednio 24% i 32% pacjentów z NDRP [32, 33].

Warto zauważyć, że zastosowanie panelu markerów reprezentujących różne typy zmian genetycznych i epigenetycznych, takich jak mutacje, niestabilność mikrosatelitarna, hipermetylacje, a także ilościowa ocena krążącego DNA poprawia znacząco odsetek dodatnich wyników. Dla przykładu wykorzystanie panelu oceniającego hipermetylację p16, zmiany mikrosatelitarne oraz poziom krążącego DNA u pacjentów z NDRP zwiększyły czułość badania do 62-80% [33]. Z kolei Andriani i wsp. wykazali, że dodatni wynik badań DNA osocza z wykorzystaniem 3 markerów – mutacji TP53, niestabilności mikrosatelitarnej FHIT i regionu chromosomalnego 3p efektywnie identyfikował 68,2% (15 z 22) pacjentów z rakiem płuca w stadium I oraz 64,8% (29 z 45) niezależnie od stadium rozwoju nowotworu [34].

Wiele tkanek, także nowotworowych, jest również źródłem specyficznych mikroRNA, czyli krótkich, niekodujących RNA, uwalnianych do krwi obwodowej. Ze zjawiskiem tym wiązane są obecnie duże nadzieje jako potencjalnym źródłem nowych możliwości diagnostycznych. MikroRNA wykazują dużą stabilność w osoczu, co umożliwia wykorzystanie wybranych transkryptów jako potencjalnych biomarkerów, na przykład we wczesnej diagnostyce raka płuca. Wykazano m.in., że podwyższona ekspresja miR-25 oraz miR-223 jest charakterystyczna dla NDRP [35].

WNIOSKI

Analiza badań publikowanych na przestrzeni ostatnich lat wydaje się uzasadniać rozpowszechnione przekonanie, że w miarę postępu technologicznego w biologii molekularnej i wprowadzania coraz bardziej czułych metod, ważnym a nawet podstawowym materiałem diagnostycznym w raku płuca stanie się krew obwodowa. Niewielka inwazyjność i niski koszt pozyskania materiału biologicznego radykalnie odróżnia ją od innych aktualnie stosowanych metod diagnostycznych i sprawia, że realny stałby się dostęp do diagnostyki molekularnej w warunkach ambulatoryjnych. Co więcej, warto pamiętać, że zgodność uzyskiwana pomiędzy wynikami oznaczeń w guzie pierwotnym oraz we krwi jest coraz wyższa. Wczesna diagnostyka raka płuca oparta o markery molekularne, ma więc realne szanse, aby stać się faktem. Jednak jej praktyczne zastosowanie kliniczne nadal wymaga intensywnych badań.

..............................................................................................................................................................

Praca powstała w ramach grantu N 402459437 finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E i Forman D: Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011; 61: 69-90.

2.    US CSWG (2009) United States Cancer Statistics: 1999–2005 Incidence and Mortality Web-based Report. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, and National Cancer Institute, http://www.cdc.gov/uscs

3.    Szczuka I i Roszkowski-Sliz K: Lung cancer in Poland in 1970-2004. Pneumonol Alergol Pol 2008; 76: 19-28.

4.    Borczuk AC, Qian F, Kazeros A Eleazar J, Assaad A, Sonett JR, Ginsburg M, Gorenstein L, Powell CA: Invasive size is an independent predictor of survival in pulmonary adenocarcinoma. Am J Surg Pathol 2009; 33: 462-469.

5.    Santos ES, Blaya M i Raez LE: Gene expression profiling and non-small-cell lung cancer: where are we now? Clin Lung Cancer 2009; 10: 168-173.

6.    Borczuk AC, Toonkel RL i Powell CA: Genomics of lung cancer. Proc Am Thorac Soc 2009; 6: 152-158.

7.    Duffy MJ, Napieralski R, Martens JW, Span PN, Spyratos F, Sweep FC, Brunner N, Foekens JA, Schmitt M: Methylated genes as new cancer biomarkers. Eur J Cancer 2009, 45: 335-346.

8.    Pao W i Girard N: New driver mutations in non-small-cell lung cancer. Lancet Oncol 2011; 12: 175-180.

9.    Zalcman G, Bergot E i Lechapt E: Update on nonsmall cell lung cancer. Eur Respir Rev 2010; 19: 173-185.

10.    Varella-Garcia M: Chromosomal and genomic changes in lung cancer. Cell Adh Migr 2009; 4: 100-106.

11.    Poulsen TT, Poulsen, HS, Pappot H: Molecular biology of lung cancer, w: Hansen H ‘Textbook of Lung Cancer’ 2008 Informa Healthcare, London, UK, 20-34

12.    Breuer RH, Postmus PE, Smit EF: Molecular pathology of non-small-cell lung cancer. Respiration 2005; 72: 313-330.

13.    Fong KM, Sekido Y, Gazdar AF, Minna JD: Lung cancer. 9: Molecular biology of lung cancer: clinical implications. Thorax 2003; 58: 892-900.

14.    Jassem E: Rola badań molekularnych we wczesnym wykrywaniu raka płuc. Alergia Astma Immunologia 1997; 2: 101-104.

15.    Brambilla C, Fievet F, Jeanmart M: Early detection of lung cancer: role of biomarkers. Eur Respir J 2003; 39 (Suppl.): 36-44.

16.    Chorostowska-Wynimko J, Szpechcinski A: The impact of genetic markers on the diagnosis of lung cancer: a current perspective. J Thorac Oncol 2007; 2: 1044-1051.

17.    Kennedy TC i Hirsch FR: Using molecular markers in sputum for the early detection of lung cancer: a review. Lung Cancer 2004; 45 (Suppl. 2): 21-27.

18.    Belinsky SA, Liechty KC, Gentry FD i wsp.: Promoter hypermethylation of multiple genes in sputum precedes lung cancer incidence in a high-risk cohort. Cancer Res 2006; 66: 3338-3344.

19.    Varella-Garcia M, Kittelson J, Schulte AP i wsp.: Multi-target interphase fluorescence in situ hybridization assay increases sensitivity of sputum cytology as a predictor of lung cancer. Cancer Detect Prev 2004; 28: 244-251.

20.    Jiang F, Todd NW, Qiu Q, Liu Z, Katz RL i Stass SA: Combined genetic analysis of sputum and computed tomography for noninvasive diagnosis of non-small-cell lung cancer. Lung Cancer 2009; 66: 58-63.

21.    Fielding P, Turnbull L, Prime W, Walshaw M i Field JK: Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 up-regulation in bronchial lavage specimens: a clinical marker of early lung cancer detection. Clin Cancer Res 1999; 5: 4048-4052.

22.    Chan EC, Lam SY, Tsang KW i wsp.: Aberrant promoter methylation in Chinese patients with non-small cell lung cancer: patterns in primary tumors and potential diagnostic application in bronchoalevolar lavage. Clin Cancer Res 2002; 8: 3741-3746.

23.    Ahrendt SA, Chow JT, Xu LH i wsp.: Molecular detection of tumor cells in bronchoalveolar lavage fluid from patients with early stage lung cancer. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 332-339.

24.    Ferretti G, Curigliano G, Pastorino U i wsp.: Detection by denaturant gradient gel electrophoresis of tumor-specific mutations in biopsies and relative bronchoalveolar lavage fluid from resectable non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2000; 6: 2393-2400

25.    Mandel P i Metais P: Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme.; C R Seances Soc Biol Fil 1948; 142: 241-243.

26.    Fournie GJ, Courtin JP, Laval F i wsp.: Plasma DNA as a marker of cancerous cell death. Investigations in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing human tumours. Cancer Lett 1995; 91: 221-227.

27.    Sozzi G, Conte D, Leon M i wsp.: Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol 2003; 21: 3902-3908.

28.    Sozzi G, Roz L, Conte D i wsp.: Plasma DNA quantification in lung cancer computed tomography screening: five-year results of a prospective study. Am J Respir Crit Care Med 2009; 179: 69-74.

29.    Dziadziuszko R i Hirsch FR: Advances in genomic and proteomic studies of non-small-cell lung cancer: clinical and translational research perspective. Clin Lung Cancer 2008; 9: 78-84.

30.    Beau-Faller M, Weber JC, Schneider A i wsp.: Genetic heterogeneity in lung and colorectal carcinoma as revealed by microsatellite analysis in plasma or tumor tissue DNA. Cancer 2003; 97: 2308-2317.

31.    Ulivi P, Zoli W, Calistri D i wsp.: p16INK4A and CDH13 hypermethylation in tumor and serum of non-small cell lung cancer patients. J Cell Physiol 2006; 206: 611-615.

32.    Sozzi G, Conte D, Mariani L i wsp.: Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Cancer Res 2001; 61: 4675-4678.

33.    Bearzatto A, Conte D, Frattini M i wsp.: p16(INK4A) Hypermethylation detected by fluorescent methylation-specific PCR in plasmas from non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2002; 8: 3782-3787.

34.    Andriani F, Conte D, Mastrangelo T i wsp.: Detecting lung cancer in plasma with the use of multiple genetic markers. Int J Cancer 2004; 108: 91-96.

35.    Chen X, Ba Y, Ma L i wsp.: Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res 2008; 18: 997-1006.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Joanna Chorostowska-Wynimko
Samodzielna Pracownia
Diagnostyki Molekularnej i Immunologii
Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie
ul. Płocka 26, 01-138 Warszawa
tel.: 22 43 12 158, fax 22 43 12 358
e-mail: immuno@igichp.edu.pl

Pracę nadesłano: 25.06.2011 r.
Przyjęto do druku: 01.10.2011 r.