Nowoczesne techniki biologii molekularnej są skutecznym narzędziem diagnostycznym szeroko stosowanym w nowoczesnej medycynie. W ostatnich latach rośnie ich znaczenie również w klinice raka płuca, w miarę wdrażania do codziennej praktyki wyników intensywnych badań naukowych. Niedrobnokomórkowy rak płuca jest trudnym celem diagnostycznym zarówno ze względu na znaczące zróżnicowanie klonów komórek nowotworowych w samym guzie, jak również utrudniony dostęp do dobrego jakościowo, informatywnego materiału diagnostycznego [1]. W miarę rozwoju nowotworu zmienia się również profil ekspresji markerów molekularnych. Dlatego też scharakteryzowanie zaburzeń molekularnych towarzyszących kolejnym stadiom rozwoju niedrobnokomórkowego raka płuca mających jednocześnie walor diagnostyczny nastręcza wielu trudności, pomimo bardzo intensywnych poszukiwań prowadzonych przez wiele ośrodków na całym świecie. W niniejszej pracy przedstawiono aktualny stan badań nad identyfikacją przydatnych klinicznie markerów molekularnych. Przedstawienie wszystkich markerów analizowanych w ostatnich latach nie byłoby możliwe ani celowe. Dlatego też skupiono się na omówieniu tych, które wydają się najbardziej obiecujące i mają ewentualne szanse na zastosowanie kliniczne.

MOLEKULARNE MARKERY PROGNOSTYCZNE

Jednym z najważniejszych praktycznych zastosowań biomarkerów molekularnych w klinice raka płuca jest wykorzystanie ich do oceny rokowania u chorych, w klasyfikacji stopnia zaawansowania guza, wczesnej diagnostyce przerzutów bądź wznowy. Wiele zespołów aktywnie pracuje nad określeniem faktycznej wartości prognostycznej poszczególnych zmian genetycznych, epigenetycznych i proteomicznych, jednak wyniki opublikowanych badań niejednokrotnie są niejednoznaczne, a nawet sprzeczne.

Wykazano, że całkowite przeżycie pacjentów w stadium I NDRP jest istotnie niższe, jeśli w komórkach guza obecne są mutacje strukturalne genu TP53. Podobne znaczenie wydaje się mieć słabsza niż u osób zdrowych ekspresja genu HIN-1 (High In Normal-1) w tkankach guza [2]. Znamienną zależność obserwowano też pomiędzy obecnością mutacji KRAS w materiale izolowanym z surowicy oraz metylacją promotorów niektórych genów (m. in. RASSF1A, DAPK, APC) a całkowitym czasem przeżycia [3]. Rosell i wsp. wskazywali na silną wartość prognostyczną mutacji KRAS w odniesieniu do podwyższonego ryzyka nawrotu choroby oraz ryzyka zgonu bez względu na typ histologiczny NDRP [4]. Również Fukuyama i wsp. stwierdzili, że mutacje KRAS, a także TP53 są negatywnym czynnikiem prognostycznym dla chorych z gruczolakorakiem, lecz nie dla pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym [5]K. Z kolei Camps i wsp. oceniając wartość prognostyczną mutacji KRAS w surowicy nie tylko nie zaobserwowali ich negatywnego związku z kluczowymi parametrami rokowniczymi, takimi jak całkowity czas przeżycia, czas przeżycia wolnego od progresji, lecz przeciwnie – wykazali tendencję w kierunku pozytywnej zależności pomiędzy występowaniem mutacji KRAS a dłuższym czasem przeżycia [6]. Wydaje się jednak, że wątpliwości w znacznym stopniu rozwiała metaanaliza przeprowadzona przez Mascaux i wsp., która potwierdziła faktyczną negatywną rolę prognostyczną mutacji onkogenu KRAS względem czasu przeżycia pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca [7].

Wiele zespołów analizowało również wartość prognostyczną całkowitego stężenia krążącego DNA oraz mikroRNA we krwi obwodowej. Stwierdzono m. in., że wysoki poziom ekspresji transkryptu miR-21 jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym dla chorych z NDRP [8]. Z kolei całkowite stężenie wolnego-krążącego DNA w osoczu znamiennie korelowało ze stopniem zaawansowania nowotworu oraz rokowaniem co do czasu przeżycia. Wykazano, że dynamika wzrostu stężenia DNA u pacjentów po leczeniu operacyjnym była w istotnym stopniu większa w przypadku wznowy lub niepełnej resekcji, natomiast stężenie DNA w osoczu po udanej radykalnej resekcji guza płuca było średnio ponad 3-krotnie niższe niż w przypadku nieudanego zabiegu bądź nawrotu choroby (7,1 vs 24,7 ng mL-1) [9, 10, 11]. W podobnym kontekście przydatność biomarkerów analizowali Kim i wsp., którzy powiązali hipermetylację promotorów p16 oraz FHIT z krótszym czasem wolnym od progresji i większym ryzykiem wznowy wśród pacjentów operowanych w I stadium NDRP [12]. Pojawiły się również sugestie, że biomarkery mogą być przydatne w kwalifikacji pacjentów do leczenia operacyjnego NDRP. Mohamed i wsp. stwierdzili, że ekspresja białek p21/WAF1 (CDK-interacting protein 1) i p16 w materiale resekcyjnym jest pozytywnym czynnikiem prognostycznym u pacjentów operacyjnych w stadium N2 NDRP [13].

Jak wspomniano powyżej, prowadzone są intensywne badania nad wykorzystaniem metod molekularnych w analizie patomorfologicznej oraz ocenie stopnia zaawansowania raka płuca, w szczególności raka gruczołowego. Stwierdzono m. in. że profil ekspresji mikroRNA jest charakterystyczny dla określonego typu tkanki. Lebanony i wsp. analizując preparaty FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded; preparaty utrwalone formaliną, zatopione w parafinie) osiągnęli 96-procentową czułość i 90-procentową swoistość w różnicowaniu komórek raka drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego [14]. Co więcej, profil mikroRNA jest istotnie odmienny w materiale pochodzącym z guza pierwotnego i przerzutów [15]. Garber i wsp. wykorzystując analizę mikromacierzy dla cDNA (complementary DNA) 24000 transkryptów przebadali materiał od 47 chorych na NDRP i opisali trzy odmienne profile ekspresji genów. Ich istotna wartość prognostyczna została następnie potwierdzona w analizie prospektywnej, w której wyraźnie udało się zróżnicować chorych z potencjalnie dłuższym i krótszym czasem przeżycia [16]. Podobnie Raponi i wsp. opisali dwa profile ekspresji genów, charakteryzujące gruczolakoraka i raka płaskonabłonkowego, które wprawdzie nie wykazywały żadnego związku z klasyfikacją TNM, jednak znamiennie korelowały z całkowitym czasem przeżycia pacjentów [17].

Optymistycznie odnosząc się do perspektyw zastosowania opisanych metod w praktyce klinicznej należy jednak podkreślić, że interpretacja wyników badań mikromacierzy RNA bywa często trudna, a niekiedy i mało wiarygodna – zwłaszcza w małych liczebnie grupach chorych. Trudności związane z krytyczną oceną wyników znajdują swoje odzwierciedlenie w małej spójności pomiędzy prognostycznymi profilami ekspresji genów proponowanymi przez różne grupy badawcze. Również badania nad przydatnością prognostyczną ekspresji mikroRNA w raku płuca wymagają dalszej gruntownej weryfikacji, choć nadzieje na ich praktyczne zastosowanie wydają się w pełni uzasadnione.

MOLEKULARNE MARKERY PREDYKCYJNE

Podczas gdy zastosowanie metod molekularnych w diagnostyce i ocenie rokowania u chorych na raka płuca nadal pozostaje w sferze badań, molekularne markery predykcyjne znajdują już zastosowanie w praktyce klinicznej pozwalając w realny sposób ocenić szanse uzyskania dobrej odpowiedzi na leczenie lub zidentyfikować chorych na NDRP szczególnie predystynowanych do konkretnych schematów leczenia. Aktualnie badanych jest bardzo wiele potencjalnych markerów predykcyjnych, kilka algorytmów diagnostycznych jest weryfikowanych bądź wdrażanych, a jeden z nich znalazł już swoje miejsce w zalecanym standardzie postępowania klinicznego [18, 19]

Liczne badania przedkliniczne i kliniczne potwierdzają realną przydatność oceny ekspresji genu BRCA1 (Breast Cancer 1, early onset) jako markera predykcyjnego odpowiedzi na cisplatynę i inne leki uszkadzające DNA (etopozyd, bleomycyna). Nadekspresja BRCA1 silnie wiąże się z opornością na te preparaty oraz ze zwiększoną podatnością na działanie winorelbiny i innych leków wiążących się z tubuliną (działanie antymitotyczne). Z kolei metylacja tego genu sygnalizuje zależność odwrotną, a więc wzrost podatności na cisplatynę i jej pochodne a także spadek odpowiedzi na wykazujące powinowactwo do mikrotubul preparaty działające antymitotycznie [20, 21].

Udowodniono również, że wysoka ekspresja genów ERCC1 (Excision Repair Cross-complementing rodent repair deficiency, Complementation group 1) oraz RRM1 (Ribonucleoside-diphosphate Reductase M1) jest związana ze skróconym, a ich niska ekspresja – z wydłużonym czasem przeżycia pacjentów z zaawansowaną postacią NDRP leczonych cisplatyną i gemcytabiną [22]. Ostatnio Bepler i wsp. badając grupę 784 chorych na NDRP przekonująco potwierdzili, że niski poziom ekspresji białek ERCC1 oraz RRM1 w materiale resekcyjnym jest czynnikiem predykcyjnym dobrej odpowiedzi na leczenie adjuwantowe (odpowiednio HR=0,73 i HR=0,84) [23]. U chorych poddanych wyłącznie leczeniu chirurgicznemu wysoka ekspresja obu markerów była związana z wydłużonym czasem przeżycia (Overall Survival) oraz czasem wolnym od progresji choroby (PFS – Progression-Free Survival), w stosunku do pacjentów o niskim poziomie ekspresji obu białek lub podwyższonej ekspresji tylko jednego z nich [24]. Tak więc niski poziom ekspresji ERCC1 oraz RRM1 jest korzystnym czynnikiem predykcyjnym odpowiedzi na terapię związkami cisplatyny i gemcytabiną oraz jednocześnie negatywnym czynnikiem prognostycznym dla pacjentów nie stosujących tej terapii [25]. Wykazano też, że stwierdzenie konkretnych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) w genie ERCC1 wydaje się wiązać ze stabilnością DNA i odpowiedzią na chemioterapię, a szczególnie leki działające w oparciu o mechanizm uszkadzania DNA [26]. Ryzyko toksycznego działania terapii opartych na pochodnych platyny jest znamiennie wyższe u nosicieli co najmniej jednego allelu A genu ERCC1 [27].

Najważniejszym i jak na razie jedynym molekularnym markerem predykcyjnym o uznanej wartości klinicznej w diagnostyce NDRP są mutacje somatyczne genu EGFR. Ich obecność jest związana z korzystną odpowiedzią na leczenie inhibitorami kinazy tyrozynowej (TKI – Tyrosine Kinase Inhibitors) (erlotynib, gefitinib) u chorych na NDRP. Wprawdzie wzmożona ekspresja EGFR jest relatywnie częstym zjawiskiem w NDRP, jednak mutacje aktywujące receptor EGF (Epithelial Growth Factor) występują średnio u około 10% pacjentów NDRP rasy kaukaskiej (3-25% w populacji amerykańskiej, 10-24% w populacji południowoeuropejskiej) oraz u 30-67% chorych pochodzenia azjatyckiego [28].

Mutacje aktywujące występują w obrębie eksonów 18-21 genu EGFR, które kodują domenę kinazową białka receptora nabłonkowego czynnika wzrostu i powodują jego konstytutywną aktywację. Obecność mutacji aktywujących związana jest również ze zwiększonym powinowactwem receptora do cząsteczki inhibitora i indukcją wzmożonej apoptozy komórek guza w odpowiedzi na terapię TKI.

Najczęściej występującymi zmianami (~90%) o charakterze mutacji aktywujących są niewielkie delecje w obrębie aminokwasów 746-753 w eksonie 19 oraz mutacja punktowa powodująca substytucję leucyny w argininę w kodonie 858 (L858R) w eksonie 21. Ze szczególnie silną odpowiedzią na leczenie TKI związane jest występowanie delecji [30] oraz dość rzadkich podwójnych mutacji aktywujących [31].

Korzystna reakcja na terapię TKI w ogólnej, nieselekcjonowanej populacji chorych na NDRP rasy kaukaskiej sięga jedynie 10%. Dlatego też wdrożenie do praktyki klinicznej wiarygodnego markera predykcyjnego ma kluczowe znaczenie dla efektywnego stosowania tego leczenia. Tym bardziej, że jak wykazali Mok i wsp. chorzy bez mutacji aktywujących EGFR w guzie pierwotnym odnoszą większe korzyści z klasycznej chemioterapii niż z leczenia TKI [32]. Szereg retrospektywnych i prospektywnych analiz potwierdził wysoki współczynnik odpowiedzi (Response Ratio) na terapię TKI (erlotynib, gefitinib) u pacjentów z mutacją EGFR (średnia ważona na poziomie 78%, w większości badań RR powyżej 60%) [33]. Metaanaliza siedmiu badań II fazy jednoznacznie wykazała, że zastosowanie mutacji domeny kinazowej EGFR jako głównego kryterium kwalifikacji do leczenia TKI skutkowało zwiększeniem odsetka pozytywnych odpowiedzi na leczenie do 87% oraz wydłużeniem czasu przeżycia bez progresji choroby z 7,7 do 14 miesięcy. Przy takim kryterium włączenia do terapii korzystna odpowiedź była niezależna od płci, rasy oraz nałogowego palenia tytoniu [34].

Najbardziej rozpowszechnioną metodą stosowaną w diagnostyce mutacji EGFR jest sekwencjonowanie metodą Sangera, które zapewnia wiarygodną analizę sekwencji nukleotydowej wybranych fragmentów genu [35]. Opracowano jednak szereg nowoczesnych znacznie bardziej czułych metod opartych na analizie materiału genetycznego izolowanego z komórek nowotworowych za pomocą sond molekularnych o wysokiej swoistości (Scorpion-ARMS, PNA-LNA PCR clamp) [36, 37]. Ich zaletą jest znacząco wyższa czułość w porównaniu z sekwencjonowaniem, co ma szczególne znaczenie dla analizy skąpokomórkowych materiałów biopsyjnych oraz materiałów cechujących się heterogennością. Jednak w przeciwieństwie do sekwencjonowania metody te pozwalają na identyfikację jedynie wybranych, ściśle określonych mutacji, zgodnie ze specyfiką użytych w analizie diagnostycznej sond.

Innym markerem diagnostycznym wiązanym z wrażliwością na leczenie TKI jest wysoka liczba kopii i/lub amplifikacja genu EGFR, najczęściej identyfikowana metodą FISH. Częstość występowania amplifikacji EGFR w komórkach NDRP jest szacowana na 7-45% przypadków. Tak zaskakujące rozbieżności są wynikiem różnic w stosowanej metodologii badań, ale przede wszystkim braku jednolitych kryteriów ich oceny oraz wpływu subiektywnej interpretacji badacza. Dacic i wsp., analizując preparaty tkankowe metodą FISH przy pomocy dwóch systemów oceny, uzyskali istotnie różny odsetek dodatnich wyników w tych samych materiałach (6 vs 14,5%) [38]. Nie bez znaczenia jest również fakt, iż zjawisko wysokiej polisomii oraz amplifikacji genu EGFR wydaje się pojawiać w chronologii rozwoju NDRP później niż mutacje, a więc w stadiach bardziej zaawansowanych [39].

Obecnie uważa się, że ocena amplifikacji genu EGFR metodą FISH nie ma tak silnej wartości diagnostycznej jak analiza mutacji aktywujących. Podwyższona liczba kopii EGFR jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym [40] i korzystnym, choć nie tak wiarygodnym jak analiza mutacji, czynnikiem predykcyjnym odpowiedzi na TKI. Szereg badań klinicznych fazy II i III potwierdziło wpływ leczenia TKI na wydłużenie czasu przeżycia pacjentów z dodatnim wynikiem EGFR-FISH [41]. Znamienne są jednak obserwacje opublikowane przez Capuzzo i wsp. W grupie chorych na NDRP FISH + (31% badanych) wykazali oni co prawda znamiennie wyższy stopień odpowiedzi na gefitinib (RR 36% vs 3%) i dłuższy średni czas przeżycia (18,7 vs 7 miesiąca) w porównaniu z pacjentami z normalną liczbą kopii genu EGFR w komórkach guza pierwotnego. Jednak w przypadku obecności mutacji aktywujących EGFR (17% w tej samej populacji chorych) wyniki leczenia TKI były znacząco lepsze (RR 53% vs 5%) [42]. Niezależną wartość predykcyjną EGFR-FISH podważa też fakt, iż dodatni wynik tego badania obserwowano zarówno w komórkach NDRP nie wykazujących mutacji genu EGFR, jak i tych z potwierdzoną obecnością innych mutacji wiążących się z pierwotną opornością na leczenie TKI, na przykład w genie KRAS [38]

Obok analizy mutacji i wysokiej polisomii lub amplifikacji genu EGFR intensywnie badano również przydatność oceny ekspresji białka EGFR w tkankach metodą immunohistochemii (IHC). Wiadomo, że ekspresja białka receptora dla EGF ma istotną negatywną wartość prognostyczną, jednak nie predykcyjną, jest zawodna, w dużym stopniu z powodu braku standaryzacji i zawodności metody IHC. Obecnie uważa się, że jest to metoda pozbawiona wartości diagnostycznej. Warto natomiast przypomnieć, że Hirsch i wsp. intensywnie pracujący nad opracowaniem standardowej metodologii identyfikacji EGFR metodą IHC, zaproponowali skojarzenie dwóch markerów – oceny amplifikacji genu EGFR i ekspresji receptora, wykazując że u pacjentów podwójnie pozytywnych (EGFR FISH+ i IHC+) odpowiedź na leczenie gefinitibem jest istotnie lepsza niż w grupie podwójnie negatywnej (średni czas przeżycia 21 miesięcy vs 6 miesięcy) oraz u pacjentów z mutacjami w obrębie genu EGFR [43]. Jednak wydaje się, że dopiero ewentualne pozytywne wyniki prób z nową klasą przeciwciał skierowanych przeciwko mutacjom EGFR mogą zmienić przydatność metody IHC w diagnostyce.

Trwają również badania nad uzupełnieniem panelu diagnostycznego o inne wartościowe molekularne markery predykcyjne odpowiedzi na terapię TKI. Stwierdzono na przykład, że utrata heterozygotyczności znajdującego się na krótkim ramieniu chromosomu 3 (3p LOH) genu kodującego transkrypt mikroRNA miR-128b, będącego bezpośrednim regulatorem receptora EGF, znacząco koreluje z wydłużonym czasem przeżycia i odpowiedzią kliniczną na stosowanie gefitinibu [44].

Obok markerów predykcyjnych pomocnych w ocenie wrażliwości na TKI, bardzo intensywnie poszukiwane są również markery oporności na tę grupę leków. Stosunkowo najlepiej poznanym markerem oporności pierwotnej są mutacje genu KRAS. Mutacje kodonu 2, 12, 13 lub 61 genu KRAS wykrywane są u ok. 25% pacjentów rasy kaukaskiej z gruczolakorakiem płuca [45]. Ich obecność powoduje, że pomimo stosowania EGFR-TKI utrzymuje się ciągła proliferacja komórek guza, stymulowana poprzez niezależną od pobudzenia receptora EGF aktywację szlaku sygnalizacji białka RAS [46]. Z tego powodu mutacje KRAS wiążą się z brakiem wrażliwości na inhibitory kinazy tyrozynowej [47], a także skróceniem czasu przeżycia tej grupy chorych w stosunku do leczonych klasyczną chemioterapią [48]. Wiele badań potwierdza, że regułą jest wzajemne wykluczanie się mutacji aktywujących genu EGFR i KRAS [38, 49]. W piśmiennictwie znajdują się jednak opisy przypadków ich współwystępowania, co znajduje odzwierciedlenie w procedurach diagnostycznych [48]. W niektórych ośrodkach analiza mutacji genu KRAS wykonywana jest równolegle z oceną mutacji genu EGFR. Część badań sugeruje też, że mutacje w obrębie genu KRAS wiążą się z niekorzystnym rokowaniem co do wyników klasycznej chemioterapii i leczenia adjuwantowego po resekcji [21].

Obok mutacji genu KRAS w piśmiennictwie wymienianych jest szereg innych markerów oporności pierwotnej o potencjalnym znaczeniu predykcyjnym, takich jak amplifikacja genu MET kodującego receptor dla czynnika wzrostu dla hepatocytów (HGF), amplifikacja genu kodującego HER2, występowanie fuzyjnego onkogenu EML4-ALK (Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4 – Anaplastic Lymphoma Kinase) czy też fosforylacja kinazy AKT [34]. Ich przydatność kliniczna jest obecnie bardzo intensywnie badana.

Leczenie dobrze wyselekcjonowanych grup chorych inhibitorami kinazy tyrozynowej charakteryzuje się najczęściej bardzo dobrą, niekiedy wręcz spektakularną odpowiedzią. Jednak długotrwałe przyjmowanie TKI może prowadzić do wykształcenia oporności i w konsekwencji nawrotu lub progresji choroby. Oporność wtórna jest najczęściej następstwem mutacji T790M w eksonie 20 genu EGFR (~50%), która skutkuje zwiększeniem powinowactwa receptora EGF do ATP. Z kolei amplifikacja MET, odpowiedzialna za około 20% przypadków, umożliwia niezależną od EGFR aktywację szlaku sygnałowego PI3K [50, 51].

Podejrzenie oporności wtórnej wiąże się nierzadko z koniecznością powtórnego pobrania i analizy materiału tkankowego z guza pierwotnego, co w oczywisty sposób stanowi istotny problemem kliniczny. Warto więc odnotować, że prowadzone są już badania nad możliwością oznaczania markerów odpowiedzi na TKI, takich jak mutacje aktywujące EGFR oraz mutacje KRAS, a także markerów wtórnej oporności w wolnym DNA krążącym w osoczu jako nieinwazyjnej alternatywy dla ponownej biopsji [52, 53]. Podejmowane są również próby uzyskania profilów proteomicznych osocza i surowicy, które pozwalałyby identyfikować pacjentów wrażliwych na leczenie TKI. Wstępne wyniki tych badań u chorych na NDRP są obiecujące i charakteryzują się dobrą powtarzalnością [54]. Retrospektywna analiza 441 pacjentów z badania BR.21 (erlotinib vs placebo) potwierdziła znacząco lepszą odpowiedź na leczenie oraz dłuższą medianę czasu przeżycia u pacjentów o prognozowanym profilu dobrej odpowiedzi na leczenie w stosunku do grupy o przewidywanej słabej odpowiedzi (odpowiednio 11,5% vs 1%; 10,5 vs 4 miesiące) [55]. Co ciekawe, wynik analizy proteomicznej nie koreluje w istotny sposób ze statusem mutacji EGFR i KRAS. Niewątpliwą zaletą stosowania tej techniki w praktyce byłaby jej szybkość (pełna analiza w czasie do 72 h), wykorzystanie łatwo dostępnego materiału jakim jest krew oraz możliwość zakwalifikowania do terapii celowanej chorych nie posiadających mutacji aktywujących genu EGFR i niezależnie od statusu mutacji KRAS [56].

PERSPEKTYWY DIAGNOSTYKI MOLEKULARNEJ RAKA PŁUCA

Dynamiczny rozwój technik molekularnych poszerzył zakres badań o markery oznaczane z zastosowaniem metod spektrometrii masowej (proteomika), mikromacierzy DNA (np. analiza profilu ekspresji genów, gene signature) oraz sekwencjonowania genomowego. Wykorzystanie technologii sekwencjonowania drugiej generacji (np. pirosekwencjonowania) umożliwia równoczesny odczyt sekwencji nukleotydowej dużych obszarów genomu, pozwalając na wydajną analizę wielu markerów genetycznych oraz określenie profilu zmian mutacyjnych występujących w komórkach nowotworowych [57], a także na uzyskanie bardzo wysokiej czułości detekcji zmian określonych genów [58]. Wprowadzenie tych technik do praktyki klinicznej oznaczałoby nie tylko dostępność nowych markerów, ale również przyjęcie całkowicie nowej strategii prowadzenia badań molekularnych wymagającej wysokiego poziomu koordynacji działań w zakresie logistyki, nowoczesnych technologii, analityki oraz bioinformatyki. Dla przykładu, Balko i Coldren zaproponowali nowy wielowariancyjny model oceny wzorów ekspresji genów, który miałby umożliwiać znacznie dokładniejszą ocenę potencjalnej odpowiedzi na leczenie TKI [59]. Podejmowane są również podobnie obiecujące próby opracowania całkowicie nowych algorytmów postępowania z wykorzystaniem metod analizy proteomicznej [60]. Rozwój technologii pozwalającej na wydajne analizy molekularne ludzkiego genomu stworzyło podstawy do zakrojonych na szeroka skalę badań populacyjnych, takich jak The Cancer Genome Atlas (TCGA) [61] czy zakładający poznanie somatycznych zmian genetycznych zaangażowanych w rozwój nowotworów u człowieka Cancer Genome Project [62]. Dane dotyczące mutacji somatycznych w nowotworach są systematyzowane dzięki projektowi COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) [63].

PODSUMOWANIE

Aktualny stan wiedzy o różnicach w mechanizmach warunkujących powstawanie i regulujących wzrost raka płuca u indywidualnych pacjentów a także bardzo intensywny rozwój nowych technik diagnostycznych pozwala oczekiwać relatywnie szybkiego wdrożenia markerów molekularnych do praktyki klinicznej. Ich zastosowanie we wczesnej diagnostyce, ocenie rokowania i planowaniu leczenia należy traktować jako oczywisty kierunek rozwoju nowoczesnej onkologii układu oddechowego. W Polsce do powszechnego użytku klinicznego wprowadzono już analizę mutacji somatycznych EGFR jako element kwalifikacji pacjentów do leczenia TKI, a wdrożenie kolejnych testów pozostaje kwestią czasu. Intensywnie badane są również nowe technologie biologii molekularnej, które otwierają całkowicie nowe perspektywy jakościowej i ilościowej analizy – nie pojedynczych lecz nawet tysięcy markerów i stworzenia niezwykle szczegółowych wieloelementowych algorytmów diagnostycznych, o wielokrotnie wyższej czułości i swoistości niż obecnie stosowane.

Rutynowe stosowanie diagnostyki molekularnej, szczególnie w tak szerokim zakresie, wydaje się obecnie zbyt kosztowne i nadal bardzo odległe od praktyki klinicznej. Jednakże przykład dynamicznego rozwoju technik sekwencjonowania genomu jest doskonałym dowodem jak szybko maleją koszty stosowania nowoczesnych technologii molekularnych, pozwalając na ich powszechne stosowanie nie tylko w działalności naukowej, ale i diagnostycznej. Należy też pamiętać, że opracowywane aktualnie nowe metody leczenia raka płuca oparte są najczęściej na swoistych mechanizmach molekularnych, a ich skuteczność uwarunkowana jest odpowiednim doborem wrażliwych na to leczenie chorych. Jest więc bardzo prawdopodobne, że już w niezbyt odległej przyszłości zastosowanie szerokiego panelu markerów molekularnych będzie umożliwiało praktyczne zastosowanie zindywidualizowanego podejścia do leczenia pacjentów i rozwój prawdziwie spersonalizowanej medycyny.

..............................................................................................................................................................

Praca powstała w ramach grantu N 402459437 finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Chorostowska-Wynimko J, Szpechcinski A: The impact of genetic markers on the diagnosis of lung cancer: a current perspective. J Thorac Oncol 2007; 2: 1044-1051.

2.    Marchetti A, Barassi F, Martella C i wsp.: Down regulation of high in normal-1 (HIN-1) is a frequent event in stage I non-small cell lung cancer and correlates with poor clinical outcome. Clin Cancer Res 2004; 10: 1338-1343

3.    Ramirez JL, Sarries C, de Castro PL i wsp.: Methylation patterns and K-ras mutations in tumor and paired serum of resected non-small-cell lung cancer patients. Cancer Lett 2003; 193: 207-216.

4.    Rosell R, Monzo M, Pifarre A i wsp.: Molecular staging of non-small cell lung cancer according to K-ras genotypes. Clin Cancer Res 1996; 2: 1083-1086.

5.    Fukuyama Y, Mitsudomi T, Sugio K, Ishida T, Akazawa K i Sugimachi K: K-ras and p53 mutations are an independent unfavourable prognostic indicator in patients with non-small-cell lung cancer. Br J Cancer 1997; 75: 1125-1130.

6.    Camps C, Sirera R, Bremnes R i wsp.: Is there a prognostic role of K-ras point mutations in the serum of patients with advanced non-small cell lung cancer?; Lung Cancer (2005) 50 (3):339-346.

7.    Mascaux C, Iannino N, Martin B i wsp.: The role of RAS oncogene in survival of patients with lung cancer: a systematic review of the literature with meta-analysis. Br J Cancer 2005; 92: 131-139

8.    Markou A, Tsaroucha EG, Kaklamanis L, Fotinou M, Georgoulias V i Lianidou ES: Prognostic value of mature microRNA-21 and microRNA-205 overexpression in non-small cell lung cancer by quantitative real-time RT-PCR. Clin Chem 2008; 54: 1696-1704.

9.    Gautschi O, Bigosch C, Huegli B i wsp.: Circulating deoxyribonucleic Acid as prognostic marker in non-small-cell lung cancer patients undergoing chemotherapy. J Clin Oncol 2004; 22: 4157-4164.

10.    Sozzi G, Conte D, Leon M i wsp.: Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol 2003; 21: 3902-3908.

11.    Sozzi G, Roz L, Conte D i wsp.: Plasma DNA quantification in lung cancer computed tomography screening: five-year results of a prospective study. Am J Respir Crit Care Med 2009; 179: 69-74.

12.    Kim JS, Kim JW, Han J, Shim YM, Park J i Kim DH: Cohypermethylation of p16 and FHIT promoters as a prognostic factor of recurrence in surgically resected stage I non-small cell lung cancer. Cancer Res 2006; 66: 4049-4054.

13.    Mohamed S, Yasufuku K, Hiroshima K i wsp.: Prognostic implications of cell cycle-related proteins in primary resectable pathologic N2 nonsmall cell lung cancer. Cancer 2007; 109: 2506-2514.

14.    Lebanony D, Benjamin H, Gilad S i wsp.: Diagnostic assay based on hsa-miR-205 expression distinguishes squamous from nonsquamous non-small-cell lung carcinoma. J Clin Oncol 2009; 27: 2030-2037.

15.    Baffa R, Fassan M, Volinia S i wsp.: MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets. J Pathol 2009; 219: 214-221.

16.    Singhal S, Miller D, Ramalingam S i Sun SY: Gene expression profiling of non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2008; 60: 313-324.

17.    Raponi M, Zhang Y, Yu J i wsp.: Gene expression signatures for predicting prognosis of squamous cell and adenocarcinomas of the lung. Cancer Res 2006; 66: 7466-7472.

18.    Pao W i Girard N: New driver mutations in non-small-cell lung cancer. Lancet Oncol 2011; 12: 175-180.

19.    Pirker R, Herth FJ, Kerr KM i wsp.: Consensus for EGFR mutation testing in non-small cell lung cancer: results from a European workshop. J Thorac Oncol 2010; 5: 1706-1713.

20.    Taron M, Rosell R, Felip E i wsp.: BRCA1 mRNA expression levels as an indicator of chemoresistance in lung cancer. Hum Mol Genet 2004; 13: 2443-2449.

21.    Rosell R, Cuello M, Cecere F i wsp.: Usefulness of predictive tests for cancer treatment. Bull Cancer 2006; 93: E101-108.

22.    Su C, Zhou S, Zhang L i wsp.: ERCC1, RRM1 and BRCA1 mRNA expression levels and clinical outcome of advanced non-small cell lung cancer. Med Oncol  2010; 28:

23.    Bepler G, Olaussen KA, Vataire AL i wsp.: ERCC1 and RRM1 in the international adjuvant lung trial by automated quantitative in situ analysis. Am J Pathol 2011; 178: 69-78.

24.    Zheng Z, Chen T, Li X, Haura E, Sharma A i Bepler G: DNA synthesis and repair genes RRM1 and ERCC1 in lung cancer. N Engl J Med 2007; 356: 800-808.

25.    Singh N i Aggarwal AN: ERCC1 and RRM1 Expression in nonsmall cell lung cancer – the good, the bad and the unknown. J Thorac Oncol 2009; 4: 1042-1043.

26.    Isla D, Sarries C, Rosell R i wsp.: Single nucleotide polymorphisms and outcome in docetaxel-cisplatin-treated advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol 2004; 15:1194-1203.

27.    Suk R, Gurubhagavatula S, Park S i wsp.: Polymorphisms in ERCC1 and grade 3 or 4 toxicity in non-small cell lung cancer patients. Clin Cancer Res 2005; 11: 1534-1538.

28.    Liang Z, Zhang J, Zeng X, Gao J, Wu S i Liu T: Relationship between EGFR expression, copy number and mutation in lung adenocarcinomas. BMC Cancer 2010; 10: 376.

29.    Sequist LV i Lynch TJ: EGFR tyrosine kinase inhibitors in lung cancer: an evolving story. Annu Rev Med 2008; 59: 429-442.

30.    Sharma SV, Bell DW, Settleman J i Haber DA: Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer 2007; 7: 169-181.

31.    Hata A, Katakami N, Fujita S i wsp.: Frequency of EGFR and KRAS mutations in Japanese patients with lung adenocarcinoma with features of the mucinous subtype of bronchioloalveolar carcinoma. J Thorac Oncol 2010; 5: 1197-1200.

32.    Mok TS, Wu YL, Thongprasert S i wsp.: Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med 2009; 361: 947-957.

33.    Sequist LV, Bell DW, Lynch TJ i Haber DA: Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer.
J Clin Oncol 2007; 25: 587-595.

34.    Zhang X i Chang A: Molecular predictors of EGFR-TKI sensitivity in advanced non-small cell lung cancer. Int J Med Sci 2008; 5: 209-217.

35.    Penzel R, Sers C, Chen Y i wsp.: EGFR mutation detection in NSCLC--assessment of diagnostic application and recommendations of the German Panel for Mutation Testing in NSCLC. Virchows Arch 2011; 458: 95-98.

36.    Horiike A, Kimura H, Nishio K i wsp.: Detection of epidermal growth factor receptor mutation in transbronchial needle aspirates of non-small cell lung cancer. Chest 2007; 131: 1628-1634.

37.    Tanaka T, Nagai Y, Miyazawa H i wsp.: Reliability of the peptide nucleic acid-locked nucleic acid polymerase chain reaction clamp-based test for epidermal growth factor receptor mutations integrated into the clinical practice for non-small cell lung cancers. Cancer Sci 2007; 98: 246-252.

38.    Dacic S, Shuai Y, Yousem S, Ohori P i Nikiforova M: Clinicopathological predictors of EGFR/KRAS mutational status in primary lung adenocarcinomas. Mod Pathol 2009; 23: 159-168.

39.    Soh J, Toyooka S, Ichihara S i wsp.: Sequential molecular changes during multistage pathogenesis of small peripheral adenocarcinomas of the lung. J Thorac Oncol 2008; 3: 340-347.

40.    Hirsch FR i Witta S: Biomarkers for prediction of sensitivity to EGFR inhibitors in non-small cell lung cancer. Curr Opin Oncol 2005; 17: 118-122.

41.    Hirsch FR, Varella-Garcia M, McCoy J i wsp.: Increased epidermal growth factor receptor gene copy number detected by fluorescence in situ hybridization associates with increased sensitivity to gefitinib in patients with bronchioloalveolar carcinoma subtypes: a Southwest Oncology Group Study. J Clin Oncol 2005; 23: 6838-6845.

42.    Cappuzzo F, Hirsch FR, Rossi E i wsp.: Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst 2005; 97: 643-655.

43.    Hirsch FR, Varella-Garcia M, Cappuzzo F i wsp.: Combination of EGFR gene copy number and protein expression predicts outcome for advanced non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. Ann Oncol 2007; 18: 752-760.

44.    Weiss GJ, Bemis LT, Nakajima E i wsp.: EGFR regulation by microRNA in lung cancer: correlation with clinical response and survival to gefitinib and EGFR expression in cell lines. Ann Oncol 2008; 19: 1053-1059.

45.    Pao W, Wang TY, Riely GJ i wsp.: KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PLoS Med 2005; 2: e17.

46.    Riely GJ, Kris MG, Rosenbaum D i wsp.: Frequency and distinctive spectrum of KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res 2008; 14: 5731-5734.

47.    Zhu CQ, da Cunha Santos G, Ding K i wsp.: Role of KRAS and EGFR as biomarkers of response to erlotinib in National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group Study BR.21. J Clin Oncol 2008; 26: 4268-4275.

48.    Eberhard DA, Johnson BE, Amler LC i wsp.: Mutations in the epidermal growth factor receptor and in KRAS are predictive and prognostic indicators in patients with non-small-cell lung cancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib. J Clin Oncol 2005; 23: 5900-5909.

49.    Kosaka T, Yatabe Y, Endoh H, Kuwano H, Takahashi T i Mitsudomi T: Mutations of the epidermal growth factor receptor gene in lung cancer: biological and clinical implications. Cancer Res 2004; 64: 8919-8923.

50.    Engelman JA, Zejnullahu K, Mitsudomi T i wsp.: MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science 2007; 316: 1039-1043.

51.    Engelman JA i Janne PA: Mechanisms of acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2008; 14: 2895-2899.

52.    Kuang Y, Rogers A, Yeap BY i wsp.: Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2009; 15: 2630-2636.

53.    Wang S, An T, Wang J i wsp.: Potential clinical significance of a plasma-based KRAS mutation analysis in patients with advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2010; 16: 1324-1330.

54.    Chung CH, Seeley EH, Roder H i wsp.: Detection of tumor epidermal growth factor receptor pathway dependence by serum mass spectrometry in cancer patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2010; 19: 358-365.

55.    Carbone D (April 2010) 2nd European Lung Cancer Conference

56.    Carbone DP, Salmon JS, Billheimer D i wsp.: VeriStrat classifier for survival and time to progression in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients treated with erlotinib and bevacizumab. Lung Cancer 2010; 69: 337-340.

57.    Pleasance ED, Stephens PJ, O’Meara S i wsp.: A small-cell lung cancer genome with complex signatures of tobacco exposure. Nature 2010; 463: 184-190.

58.    Rodriguez-Nieto S, Canada A, Pros E i wsp.: Massive parallel DNA pyrosequencing analysis of the tumor suppressor BRG1/SMARCA4 in lung primary tumors. Hum Mutat 2011; 32: E1999-2017.

59.    Balko JM, Potti A, Saunders C, Stromberg A, Haura EB i Black EP: Gene expression patterns that predict sensitivity to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in lung cancer cell lines and human lung tumors. BMC Genomics 2006; 7: 289.

60.    Taguchi F, Solomon B, Gregorc V i wsp.: Mass spectrometry to classify non-small-cell lung cancer patients for clinical outcome after treatment with epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors: a multicohort cross-institutional study. J Natl Cancer Inst 2007; 99: 838-846.

61.    The Cancer Genome Atlas (TCGA), http://cancergenome.nih.gov/

62.    Cancer Genome Project, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/

63.    Forbes SA, Tang G, Bindal N i wsp.: COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer): a resource to investigate acquired mutations in human cancer. Nucleic Acids Res 2010; 38 (Database issue): D652-657.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Joanna Chorostowska-Wynimko
Samodzielna Pracownia
Diagnostyki Molekularnej i Immunologii
Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie
ul. Płocka 26, 01-138 Warszawa
tel.: 22 43 12 158, fax: 22 43 12 358
e-mail: immuno@igichp.edu.pl

Pracę nadesłano: 25.06.2011 r.
Przyjęto do druku: 01.10.2011 r.